Η συμβολή της Μεσογειακής χλωρίδας στην προστασία των μικρών μηρυκαστικών έναντι των γαστρεντερικών παρασίτων

Abstract

Worldwide, gastrointestinal nematode (GIN) infections remain a serious threat for grazing ruminants, as they affect both their health and welfare, causing anorexia, impaired digestion and nutrient absorption with related production losses, diarrhoea, anaemia and even death. Up to now, the control of these parasites relies on repeated treatments with commercial anthelmintic drugs. However, the development and expansion of anthelmintic resistance in worm populations against one or multiple classes of has become a global threat for effective parasite control and productive livestock farming. At the same time the increasing concern of consumers about the presence of drug residues in foods and in the environment have stimulated the search for alternative or complementary solutions within the context of organic farming and sustainable agriculture. Among these alternative solutions, there are considerable and expanding interest in the search for effective plant extracts and plant-derived active components, with anthelmintic properties, strategy that is completely in line with the new priorities set by EU in the new CAP and the Green Deal. From the above bioactive plants, the most interesting ones are those which called nutraceuticals, i.e. plants which represent feed sources with extra health benefits in addition to the basic nutritional value for the animals. Regarding the active components, research results so far suggest that condensed tannins (CTs) represent the most effective plant secondary metabolites against GIN infections of ruminants. The general objective of the current study was to explore the possible anthelmintic effect of CT-rich plants, which at the same time can be food ingredients of small ruminants, against GINs in sheep breeding in Mediterranean conditions. The in vitro anthelmintic effect of 31 plant extracts from tannin rich Mediterranean plants was screened against two species gastrointestinal parasites (Haemonchus contortus and Trichostrongylus colubriformis) of sheep. Namely, alcoholic extracts of the above plant species were tested against third stage larvae (which produced from faeces from donor sheep, monospecifically infected) of both H. contortus and Tr. colubriformis by using the Larval Exsheathment Inhibition Assay, at different extract concentration (150/300/600/1200μg/mL PBS). EC50-values (half maximal effective concentration) were estimated also. According to the results, the extracts of aerial Aremonia agrimonoides and semi-dry pulp of Olea europaea showed a high anthelmintic effect, but only at the highest concentration of extract 1200μg/mL, while aerial Pyrus spinosa and Potentilla haynaldiana had a similar antiparasitic activity at 1200 and 600μg/mL. Onobrychis peloponnesiaca showed a similar high and dose-dependent effect for both parasites at the 3 highest concentration (1200/600/300μg/mL), while On. alba laconica extract proved to be more effective against L3 of H. contortus than Tr. colubriformis. Finally, aerial Alchemilla bulgarica was the only one plant extract, which proved to be more effective against L3 of Tr. colubriformis. Chemical analysis of all extracts was performed, specifically as concerns the determination of phenolic compounds (total polyphenols/TPC, total flavonoids/TFC and other phenolic compounds), and the profile of their secondary metabolites was described. Further research on the stereochemistry (type and stereostructure) of secondary metabolites would be very interesting, because several of the above plants showed anthelmintic activity. In order to evaluate the anthelmintic effect of the bioactive plants, under breeding conditions, three independent in vivo trials tested whether i) carob pod (CaBP)-containing feed had an anthelmintic effect and if yes, which was the optimal concentration in the diet; ii) whether this effect could be attributed to tannins through the polyethylene glycol (PEG) test and iii) whether there were any synergistic effects when combined with another tannin-containing feed (e.g. sainfoin). In all trials 6-month-old nematode-naive lambs, experimentally infected with both H. contortus and Tr. colubriformis, were used. Faecal egg counts (FEC) were performed regularly and at the end of each trial adult worm counts (AWC) and female worm fecundity were recorded. In Trial 1, 35 lambs (five groups of seven lambs) were fed different CaBP concentrations ranging from 0% to 12 % w/w. FEC declined up to 39.2 % only in the group fed with 12 % CaBP, while a declining trend (P = 0.058) was demonstrated for the AWC of Tr. colubriformis, which was associated with the increasing concentration of CaBP in feed. Female worm fecundity was reduced in groups fed CaBP for both parasites, however this was only significant for H. contortus (P < 0.05), in a dose dependent manner. In Trial 2, four groups of six infected lambs each were used, which received the carob diets CaBP or CaBP + PEG, and the tannin-free diets with or without PEG (C or C + PEG). Results showed that FEC of Groups C, C + PEG, and CaBP + PEG were comparable throughout the trial, while the group receiving only CaBP showed lower FEC from DAY 25 onwards. AWC showed a reduction (67.7 %) only for H. contortus (P < 0.05). Reversal of the anthelmintic effect of CaBP after PEG administration suggested that CT contributed to the anthelmintic action. However, no effect of CaBP was observed on Tr. colubriformis AWC and on female worm fecundity for both species. Finally, for Trial 3 four groups of six lambs each received a diet based on CaBP, sainfoin (S) or a combination (CaBP + S) and were compared to a control (C) diet of lucerne. On DAY 37 FEC values in groups CaBP + S and S tended to be lower compared to the two other groups (C, CaBP), while for AWCs no significant differences were observed for both parasites. The fecundity of H. contortus and Tr. colubriformis demonstrated significant differences (P < 0.05) between the treated and control groups, with lower values in the animals receiving CaBP + S. Overall, the results supported the hypothesis that carob had an anthelmintic effect due to its CT, but there was no clear indication of a synergistic effect with sainfoin. In conclusion, the results of this PhD thesis confirmed that several plants, commonly found in the Mediterranean region are rich in active secondary metabolites showing anthelmintic effect against GINs of small ruminants. This effect, as recorded in in vitro studies its worth to be further investigated. In addition, when selected plants fed to sheep it has been shown that: i) their consumption can modulate the biology of GINs in vivo as well; ii) the CT seem to be mainly involved in the anthelmintic effects (e.g., as it has been demonstrated for carob); iii) the concentration in the feed of those resources influenced the anthelmintic effects and iv) different mechanisms appeared to affect their activity. Precisely, the reduction of FECs recorded in the in vivo trial could be either attributed to a reduced fecundity of female adult worms (see Trial 1 and 3) and /or to a reduction of the number of the adult worms in the gut (see Trial 2). In future studies, the results of the current thesis should be further confirmed on studies conducted in on-farm conditions enrolling animals naturally infected with GINs.

Ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα τόσο στη χώρα μας, όσο και παγκοσμίως, είναι η μόλυνση των μικρών μηρυκαστικών από γαστρεντερικά νηματώδη παράσιτα της οικογένειας Trichostrongylidae. Αυτό γιατί η συχνότητα εμφάνισης αυτών, σε συνδυασμό με την εκτεταμένη εξάπλωση τους απειλούν την υγεία και την ευζωία των ζώων και μειώνουν την ποσότητα και την ποιότητα των παραγόμενων ζωικών προϊόντων, με αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του αγροτικού εισοδήματος των κτηνοτρόφων. Σε συστήματα εκτροφής που βασίζονται σε μεγάλο βαθμό στη βόσκηση, όπως τα ημιεκτατικά και τα ημιεντατικά που επικρατούν στη χώρα μας, η μόλυνση των ζώων από γαστρεντερικά νηματώδη παράσιτα θεωρείται δεδομένη. Μέχρι σήμερα, η αντιμετώπιση των γαστρεντερικών νηματωδών γίνονταν τόσο προληπτικά, όσο και θεραπευτικά με τη χρήση ανθελμινθικών φαρμάκων ευρέως φάσματος, πρακτική που αποδείχθηκε αποτελεσματική, ασφαλής και οικονομικά αποδοτική. Όμως η εμφάνιση και η συχνότητα ανάπτυξης στελεχών των παρασίτων ανθεκτικών στα φάρμακα, φαινόμενο γνωστό με τον όρο «ανθελμινθικοαντοχή», σε συνδυασμό με την ανησυχία των καταναλωτών για υπολείμματα φαρμάκων στα παραγόμενα προϊόντα και το περιβάλλον, οδήγησε στην αναζήτηση εναλλακτικών/συμπληρωματικών τρόπων αντιμετώπισης των παρασιτώσεων. Σήμερα η χρήση βιοενεργών φυτών, δηλαδή φυτών πλούσιων σε δευτερογενείς μεταβολίτες με ανθελμινθική δράση αποτελεί αντικείμενο ερευνητικής δραστηριότητας, που συνάδει και με την πολιτική της ΕΕ για πράσινη ανάπτυξη. Από τα φυτά αυτά, ιδιαίτερο ερευνητικό ενδιαφέρον παρουσιάζουν αυτά που όχι μόνο εμφανίζουν ανθελμινθική δράση, αλλά συνεισφέρουν και σαν συστατικά της διατροφής των μικρών μηρυκαστικών, γνωστά με τον αγγλικό όρο «nutraceuticals». Σε ότι αφορά τους δευτερογενείς μεταβολίτες, η μελέτη της ομάδας των συμπυκνωμένων ταννινών των φυτών (CT) με πιθανή δράση έναντι των γαστρεντερικών νηματωδών, συνιστά μέχρι σήμερα ελκυστική προσέγγιση επίλυσης του προβλήματος. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση και αξιολόγηση της πιθανής ανθελμινθικής δράσης φυτικών ειδών της χώρας μας, που είναι πλούσια σε δευτερογενείς μεταβολίτες, έναντι των γαστρεντερικών παρασίτων των προβάτων και αποτελούν συγχρόνως και συστατικά διατροφής των μικρών μηρυκαστικών. Για το σκοπό αυτό, αρχικά διερευνήθηκε και αξιολογήθηκε η ανθελμινθική δράση 31 φυτικών εκχυλισμάτων σε in vitro δοκιμές. Αλκοολούχα εκχυλίσματα των ειδών αυτών ελέγχθηκαν με τη Δοκιμή της Έκδυσης των Προνυμφών (Larval Exsheathment Inhibition Assay/LEIA) σε 5 διαφορετικές συγκεντρώσεις (150-1.200μg/mL), για την ανθελμινθική τους δράση έναντι των γαστρεντερικών νηματωδών Haemonchus contortus και Trichostrongylus colubriformis. Στη συνέχεια, με βάση τα αποτελέσματα της δοκιμής αυτής, υπολογίσθηκε η μέση αποτελεσματική δόση (EC50), ενάντια στα δύο είδη παρασίτων. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι εκχυλίσματα της νωπής πούλπας Olea europaea και του υπέργειου τμήματος του φυτού Aremonia agrimonoides, εμφάνισαν ανθελμινθική δράση, αλλά μόνο στην υψηλότερη συγκέντρωση των εκχυλίσματος (1.200μg/mL). Τα εκχυλίσματα από τα υπέργεια τμήματα των φυτικών ειδών Pyrus spinosa και Potentilla haynaldiana παρουσίασαν αντίστοιχη δράση τόσο στη συγκέντρωση των 1.200μg/mL, αλλά και σε αυτή των 600μg/mL εκχυλίσματος. Η ονοβρυχίδα Onobrychis peloponnesiaca παρουσίασε δοσοεξαρτώμενη ανθελμινθική δράση ενάντια και στα δύο είδη παρασίτων, ενώ η On. alba laconica μόνο έναντι του H. contortus. Το μοναδικό φυτικό είδος που εμφάνισε ανθελμινθική δράση έναντι του H. contortus, αλλά όχι έναντι του Tr. colubriformis, ήταν αυτό του υπέργειου τμήματος του είδους Alchemilla bulgarica. Στα εκχυλίσματα όλων των υπό μελέτη φυτών έγινε χημική ανάλυση με έμφαση τον προσδιορισμό των φαινολικών ενώσεων (μέτρηση των ολικών πολυφαινολών (TPC), των ολικών φλαβονοειδών (TFC) και των επιμέρους πολυφαινολών), όπου και περιεγράφηκε το προφίλ των δευτερογενών αυτών μεταβολιτών. Επειδή αρκετά από τα υπό δοκιμή φυτά παρουσίασαν ανθελμινθική δράση, ιδιαίτερο ενδιαφέρον θα είχε η στερεοχημική ανάλυση των δευτερογενών μεταβολιτών, σχετικά με το είδος και τη στερεοδομή τους και η συσχέτισή τους με τη δράση ενάντια στα παράσιτα. Για την περαιτέρω αξιολόγηση της ανθελμινθικής δράσης των βιοενεργών φυτών σε συνθήκες εκτροφής, διενεργήθηκαν πειραματισμοί σε in vivo συνθήκες. Για το σκοπό, αυτό επιλέχθηκαν 2 φυτά, οι καρποί της χαρουπιάς (Ceratonia siliqua) και η ονοβρυχίδα (Onobrychis viciifolia). Σχεδιάστηκαν και πραγματοποιήθηκαν 3 in vivo πειραματισμοί, όπου τα παραπάνω φυτά ενσωματώθηκαν στα σιτηρέσια αρνιών 6 μηνών, πειραματικά μολυσμένων με τα νηματώδη H. contortus και Tr. colubriformis. Στόχος των πειραματισμών αυτών ήταν να διερευνηθεί το αν και κατά πόσο η συμμετοχή των φυτικών αυτών ειδών στα σιτηρέσια των προβάτων, μπορεί να αντιμετωπίσει τις μολύνσεις από γαστρεντερικά νηματώδη και να επιλεγεί ο πιο αποτελεσματικότερος τρόπος χορήγησης τους π.χ. μεμονωμένα ή σε συνδυασμό και σε επιθυμητή συγκέντρωση. Συγκεκριμένα, στο Πείραμα 1 διερευνήθηκε η ανθελμινθική δράση των καρπών της χαρουπιάς σε διάφορες συγκεντρώσεις, έτσι ώστε να επιλεγεί η πιο αποτελεσματική. Στον πειραματισμό αυτό συμμετείχαν 35 ζώα (5 ομάδες των 7), στα οποία χορηγήθηκε σιτηρέσιο με προσθήκη χαρουπάλευρου (CaBP) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0%, 3%, 6% και 12% g CaBP/100g συνολικού σιτηρεσίου). Τα αποτελέσματα έδειξαν μείωση στις μέσες τιμές FEC (αυγά / g κοπράνων) και των AWC (ενήλικα παράσιτα), μόνο για τα ζώα της ομάδας όπου χορηγήθηκε η μεγαλύτερη συγκέντρωση CaBP, που όμως δεν ήταν στατιστικά σημαντικές. Όμως ήταν θετικό, που βρέθηκε αρνητική συσχέτιση της μείωσης του ποσοστού ωοτοκίας των θηλυκών παρασίτων, σε σχέση με τη συγκέντρωση CaBP στο σιτηρέσιο, υποδηλώνοντας δοσοεξαρτώμενη δράση. Δεδομένου ότι τα παράσιτα του είδους H. contortus σημειώνουν ιδιαίτερα υψηλή ημερήσια παραγωγή αυγών σε σύγκριση με του Tr. colubriformis, η μείωση των FEC οφείλεται κυρίως στην επίδραση του χαρουπιού στα παράσιτα του είδους H. contortus. Στη συνέχεια με στόχο να διερευνηθεί το αν η ανθελμινθική δράση του χαρουπιού (όπως αποδείχτηκε στο Πείραμα 1), οφείλεται στις περιεχόμενες ταννίνες του, σχεδιάστηκε το Πείραμα 2. Στην περίπτωση αυτή, τα ζώα διατρέφονταν με σιτηρέσιο πλούσιο ή μη σε χαρουπάλευρο και η δράση των ταννινών αξιολογήθηκε μετά από την προσθήκη ενός αναστολέα της δράσης των ταννινών και συγκεκριμένα της πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG). Συγκεκριμένα, στον πειραματισμό συμμετείχαν 24 αρνιά χωρισμένα σε 4 ομάδες, σε δύο από τις οποίες χορηγήθηκε CaBP ως συμπλήρωμα στην μέγιστη συγκέντρωση 12% του συνολικού σιτηρεσίου με PEG (CaBP και CaBP+PEG), ενώ στις υπόλοιπες 2 χορηγήθηκε τυπική διατροφή φτωχή σε ταννίνες επίσης με, ή χωρίς την προσθήκη PEG (Control/C και C+PEG). Τα αποτελέσματα, επιβεβαίωσαν τη δράση του χαρουπιού στα FEC, τα οποία εμφάνισαν μειώσεις 20% έως 45%, σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου. Οι εν λόγω μειώσεις παρατηρήθηκαν στο είδος H. contortus (μείωση αριθμού παραγωγής αυγών για ένα πολύ παραγωγικό είδος), αλλά όχι στο Tr. colubriformis. Η ανθελμινθική δράση του CaBP αποδόθηκε στις CT, καθότι η επίδραση του χαρουπιού στα FEC και τα ενήλικα H. contortus αναστέλλονταν στις ομάδες ελέγχου (C, C+PEG, CaBP+PEG). Καμία επίδραση του CaBP δεν υπήρξε στην ωοτοκία των θηλυκών παρασίτων. Τέλος, στο Πείραμα 3, εξετάστηκαν οι υποθέσεις εάν α) οι CT του CaBP παρουσιάζουν ισχυρότερη ανθελμινθική δράση από αυτές της ονοβρυχίδας (O. viciifolia) και β) είναι πιθανή η συνεργιστική δράση μεταξύ των παραπάνω φυτικών ειδών. Συγκεκριμένα, στον πειραματισμό συμμετείχαν 24 αρνιά χωρισμένα σε 4 ομάδες, στις οποίες χορηγήθηκε α) χαρουπάλευρο (CaBP), β) pellets ονοβρυχίδας (S) γ) συνδυασμός χαρουπάλευρου και pellets ονοβρυχίδας (CaBP+S) και δ) διατροφή με βάση τη μηδική / μάρτυρας (C). Το χαρουπάλευρο χορηγήθηκε ως συμπλήρωμα, σε ποσοστό 12% του συνολικού σιτηρεσίου, ενώ η ονοβρυχίδα ως pellet, που αντιπροσώπευε το 35% του συνολικού σιτηρεσίου. Τα αποτελέσματα του εν λόγω πειραματισμού, έδειξαν ότι υπήρχε τάση μείωσης των FEC στις ομάδες S και CaBP+S, σε σύγκριση με τις ομάδες C και CaBP, ενώ ο αριθμός των ενηλίκων παρασίτων (AWC) του H. contortus εμφανίστηκε μειωμένος στις ομάδες CaBP, S, και CaBP+S, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου με αντίστοιχα ποσοστά μείωσης 35,5%, 62,1% και 53,5%, χωρίς όμως οι διαφορές να είναι στατιστικά σημαντικές. Η ωοτοκία και των δύο ειδών παρασίτων, στις ομάδες CaBP, S και CaBP+S εμφανίστηκε σημαντικά μειωμένη σε σχέση με αυτή των μαρτύρων, γεγονός που εξηγεί ως ένα σημείο και τη μείωση των FEC που παρατηρήθηκε, δεδομένου ότι οι πληθυσμοί των ενήλικων παρασίτων δεν επηρεάστηκαν σε μεγάλο βαθμό. Αν και τα αποτελέσματα του πειραματισμού επιβεβαίωσαν την υπόθεση ότι οι ταννίνες του χαρουπιού παρουσιάζουν ανθελμινθική δράση, δεν υπάρχουν σαφείς ενδείξεις συνεργιστικής επίδρασης με την ονοβρυχίδα. Τέλος, προσδιορίστηκε η συγκέντρωση και η σύσταση των ταννινών, του χαρουπιού και της ονοβρυχίδας, με δυο διαφορετικούς τρόπους ανάλυσης α) με τη χρήση acetone-butanol-HCl assay και β) πραγματοποιώντας θειολυτική αποικοδόμηση (thiolytic degradation with benzylmercaptan). Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι οι CT του χαρουπιού που έχουν υψηλό λόγο προδελφινιδίνες / προκυανιδίνες (96,7% προδελφινιδίνες / 3,3% προκυανιδίνες), και ταυτόχρονα υψηλό βαθμό εστεροποίησης με γαλλικό οξύ (π.χ. 41,1% των υπομονάδων της φλαβαν-3όλης είναι εστεροποιημένες), δεν παρουσίασαν ισχυρότερη ανθελμινθική δράση από την ονοβρυχίδα, της οποίας οι συμπυκνωμένες ταννίνες έχουν λιγότερες προδελφινιδίνες (74,8%), που μάλιστα δεν είναι και εστεροποιημένες. Σε όλη τη διάρκεια και των 3 πειραματισμών πραγματοποιούνταν ανά τακτά διαστήματα παθοφυσιολογικές εξετάσεις (μετρήσεις αιματοκρίτη και σωματικού βάρους), τα αποτελέσματα των οποίων δεν έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες πειραματισμού. Συμπερασματικά, στην παρούσα διατριβή επιβεβαιώνεται ότι διάφορα φυτικά είδη παρουσιάζουν ανθελμινθική δράση και μάλιστα φαίνεται ότι οι συμπυκνωμένες ταννίνες ευθύνονται σε μεγάλο βαθμό για αυτήν την δράση, έναντι των γαστρεντερικών νηματωδών των μικρών μηρυκαστικών. Σε διερεύνηση που έγινε σε φυτικά είδη που απαντώνται συχνά στη Μεσόγειο, φάνηκε ότι υπάρχουν αρκετά φυτά που παρουσιάζουν τέτοιες ιδιότητες και χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης. Οι μελέτες χορήγησης καρπών χαρουπιάς και ονοβρυχίδας σε αρνιά έδειξαν ότι υπάρχει δυνατότητα μείωσης του αριθμού των αυγών των παρασίτων που εκκρίνονται με τα κόπρανα και κατά συνέπεια μείωση της έντασης της μόλυνσης των λιβαδιών. Σε ότι αφορά τον μηχανισμό δράσης των ταννινών ενάντια στα γαστρεντερικά νηματώδη, η φύση αλλά και η στερεοδομή των ταννινών πιθανά να συσχετίζονται με την ανθελμινθική δράση. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής θα ήταν επιθυμητό να επιβεβαιωθούν και σε πειραματισμούς σε συνθήκες εκτροφής και σε ζώα φυσικώς μολυσμένα από γαστρεντερικά νηματώδη.