Μυκοτοξικογόνοι μύκητες και μέθοδοι ολοκληρωμένης διαχείρισης μυκοτοξινών στην καλλιέργεια του κριθαριού και κατά τη διαδικασία της βυνοποίησης

Abstract

One of the main threats to food safety and quality is mycotoxins, particularly toxic and carcinogenic low molecular weight metabolites produced by certain species of fungi. Food losses due to mycotoxins and the cost to manage them are increasing at an alarming rate worldwide. Remarkable is the fact that about 25% of crops are infected with mycotoxins worldwide on an annual basis (FAO). Mycotoxins are produced throughout the development of crops in the field and during their storage. Similarly, their presence in animal feed may result in their transport to animal products intended for human consumption, which may have harmful effects on human health and may even lead to death. Cost-effective solutions are those that with the agricultural technology and knowledge will help to exclude fungi from the host plant and / or prevent the production of mycotoxins in their host plants with the help of an integrated environmentally friendly management system.The cultivation of barley (Hordeum vulgare L.) in our country is considered the second most important cultivation of winter cereals with the cultivated area approaching 1-1.3 million acres. Its importance is emphasized by the fact that in 2008, the Athenian Brewery started the largest contract barley cultivation program in our country, with the aim of strengthening Greek production and creating a fully vertical Greek path for its products. Fungi of the genus Fusarium spp. and Aspergillus spp. cause worldwide problems of necrosis and rot of barley seeds at pre-harvest and post-harvest level and contribute to serious production losses. Addtionally, these species are characterized by their ability to produce mycotoxins in contaminated barley, which can even be channeled into processed foods and beverages (e.g. beer) that use barley as a raw material. Contamination with mycotoxins contributes to the significant quality degradation of the product and its derivatives, while the consumption of such products can pose a serious risk to public health. The presence of mycotoxins in barley seeds can take place at all stages of the production process of cultivation (cultivation, harvesting, processing, storage, distribution) up to the stage of brewing. The main mycotoxins found in barley crops are trichothecenes (deoxylivalenol-DON, nivalenol-NIV, HT-2, T-2), zearalenone (ZEA), fumonisins (FUM), aflatoxins (AF) and ochratoxin A (OTA) and have been extensively studied due to their frequent presence in food.In our country, however, so far, there are no approved plant protection products for the treatment of fungi of the genus Aspergillus spp., While for the fungi of the genus Fusarium spp. approved active substances permitted in barley are minimal. Therefore, the need for evaluation of various active substances is considered urgent in order to study the effectiveness of existing and new active substances and preparations for the cultivation of barley.The main idea for the development of the proposal arose from the lack of a detailed report of the current situation in barley fields in terms of mycotoxins produced by species of the genera Aspergillus and Fusarium but also their population dynamics in this crop, as well as the new problem of the presence of mycotoxins in beer. This idea was reinforced by the fact that many isolates of fungi of the genera Aspergillus and Fusarium derived from barley seeds in preliminary experiments, showed extremely strong toxicogenic ability when tested by chromatographic methods in the Lab of Phytopathology in Agricultural University of Athens.Sampling of barley seeds (2017-2019) from fields all over the country, where malted or livestock barley is grown, led to the creation of a fungal collection from barley seeds consisting of 719 strains of the genus Fusarium and 421 strains of the genus Aspergillus. Most of the isolations in Fusarium spp. collection belong to the species of F. proliferatum and F. verticillioides, while in terms of their mycotoxicogenic capacity, 35% of the isolates produce trichothecenes, 43% fumonisins and 22% of the strains are non-toxicogenic. Additionally, F. verticillioides prevailed over other species of Fusarium spp. in barley fields that a high concentration of fumonisins was assessed. Regarding the results for the genus Aspergillus, the percentage of non-toxic strains in the Greek barley fields amounted to 71.26%.At the same time, 10 malt barley varieties were evaluated for their ability to inhibit the biosynthesis of mycotoxins and it was found that the most tolerant varieties of malt barley to infection with F. graminearum and deoxylivalenol biosynthesis were IRINA, SANGRIA and PLANET, while the most susceptible was AC. For A. flavus and aflatoxins biosynthesis the most susceptible was ZHANA and the GRACE variety proved to be the most tolerant. These results were correlated with the expression of genes involved in the biosynthesis of the respective mycotoxins.The evaluation of 4 biological biopesticides (Botector®, Trianum®, Remedier®, Tusal®) and 5 chemicals (Switch®, Quadris®, Neotopsin®, Madison®, Miraculix®) followed the abovementioned experimentation. The biological and chemical formulations were examined in terms of a) in vitro inhibition of F. graminearum and A. flavus conidia production, b) their ability to reduce the incidence and severity of their respective diseases and c) their ability to inhibit the biosynthesis of deoxylivalenol and aflatoxins. The plant protection products that significantly reduced the severity of Fusarium Head Blight disease were Miraculix® and Neotopsin®, while the one that reduced the severity of rots due to A. flavus infection was Switch®. In terms of deoxylivalenol production, the most effective chemicals were Neotopsin® and Miraculix® with 93.79% and 97.42% inhibition respectively, while no biological formulation gave satisfactory results in reducing deoxylivalenol. Regarding the reduction of aflatoxins, the most effective biological formulation was Trianum® with 28.65% inhibition compared to the control and the most effective chemical was Switch® with 90.76% inhibition. Also, numerous endophytic and epiphytic bacteria and yeasts were isolated from barley seeds and it was found that endemic endophytic bacteria and yeasts reduced aflatoxins by up to 35% and deoxylivalenol by up to 45%. The resistance of Fusarium spp. and A. flavus isolates was also tested in various fungicidal active substances (fludioxonil, cyprodinil, boscalid, azoxystrobin, prochloraz, prothioconazole, thiphanate-methyl, trifloxystrobin) and several strains were found to be resistant in the active substances boscalid, azoxystystrobin and troxloystrobin.Furthermore, the concentration of deoxylivalenol and aflatoxin was investigated throughout all the stages of malting process in sensitive and resistant barley varieties after the application of effective biological and chemical formulations. The results showed that Miraculix® presented the complete absence of deoxylivalenol in beer during the final malting stage while Switch® totally prevented aflatoxin contamination in beer.Finally, from the combination of all the above findings, integrated systems for the management of mycotoxins in barley were evaluated in the field, which showed that by properly combining the right variety of malt barley with the application of effective formulations during the flowering stage, the producer can effectively deal with mycotoxins. In particular, the combined application of Miraculix® and Trianum® formulations in ZHANA cultivar resulted in complete inhibition of deoxylivanelol biosynthesis in barley and beer, while the combined application of Switch® and Trianum® formulations in GRACE gave 97.8% inhibition of aflatoxins biosynthesis in barley and beer. No effective application affected the quantitative (seed weight) or qualitative characteristics (protein content) of the malt barley seed at levels that make it unsuitable for malting.In this dissertation, an integrated treatment system was created that could help reduce barley crop losses and the concentration of mycotoxins in the final product and in processed food and beverages that use barley as a raw material. Additionally, several new methods were developed for the control of mycotoxigenic fungi that cause barley seed rots and damage agricultural production qualitatively and quantitatively. The benefit which also derives from this research is particularly important as the production of beer with high organoleptic characteristics and free of mycotoxins could be further accredited by special “clean labeling” on the product, thus adding significant added value to the beer and leading to an increase in competitiveness and commerciality in the Greek and international market.

Μια από τις μεγαλύτερες απειλές για την ασφάλεια και την ποιότητα των τροφίμων είναι οι μυκοτοξίνες, ιδιαίτερα τοξικοί και καρκινογόνοι μεταβολίτες χαμηλού μοριακού βάρους που παράγονται από ορισμένα είδη μυκήτων. Οι απώλειες τροφίμων που οφείλονται σε μυκοτοξίνες και οι δαπάνες της διαχείρισής τους αυξάνονται σε ανησυχητικό επίπεδο παγκοσμίως. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι περίπου το 25% των καλλιεργειών μολύνονται με μυκοτοξίνες σε παγκόσμιο επίπεδο σε ετήσια βάση (FAO). Οι μυκοτοξίνες παράγονται καθ’ όλη τη διάρκεια της ανάπτυξης των καλλιεργειών στον αγρό αλλά και κατά την αποθήκευσή τους. Ομοίως, η παρουσία τους στις ζωοτροφές μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα τη μεταφορά τους και σε ζωικά προϊόντα που προορίζονται για κατανάλωση από τον άνθρωπο, γεγονός που μπορεί να έχει βλαβερές συνέπειες για την ανθρώπινη υγεία και να προκαλέσει μέχρι και θάνατο. Οι οικονομικά αποτελεσματικές λύσεις είναι εκείνες που με τη βοήθεια της γεωργικής τεχνολογίας και γνώσης θα συμβάλλουν στον αποκλεισμό των μυκήτων από το φυτό-ξενιστή ή/και την παρεμπόδιση παραγωγής μυκοτοξινών στα φυτά-ξενιστές τους με τη βοήθεια ενός ολοκληρωμένου συστήματος διαχείρισης φιλικού προς το περιβάλλον.Η καλλιέργεια του κριθαριού (Hordeum vulgare L.) στη χώρα μας θεωρείται η δεύτερη σημαντικότερη καλλιέργεια των χειμερινών σιτηρών με την καλλιεργούμενη έκταση να προσεγγίζει τα 1-1,3 εκατ. στρέμματα. Η σημαντικότητά της τονίζεται από το γεγονός πως το 2008, η Αθηναϊκή Ζυθοποιία ξεκίνησε το μεγαλύτερο πρόγραμμα συμβολαιακής καλλιέργειας κριθαριού στη χώρα μας, με στόχο την ενίσχυση της ελληνικής παραγωγής και τη δημιουργία μιας πλήρους καθετοποιημένης ελληνικής διαδρομής για τα προϊόντα της. Οι μύκητες του γένους Fusarium spp. και Aspergillus spp. προκαλούν σε παγκόσμιο επίπεδο σημαντικά προβλήματα νεκρώσεων και σήψεων των σπόρων του κριθαριού σε προσυλλεκτικό και μετασυλλεκτικό επίπεδο και συντελούν σε σοβαρές απώλειες στην παραγωγή. Το σημαντικότερο όμως είναι ότι διάφορα είδη Fusarium spp. και Aspergillus spp. χαρακτηρίζονται από την ικανότητά τους να παράγουν μυκοτοξίνες στο μολυσμένο κριθάρι, οι οποίες μπορούν να διοχετεύονται ακόμη και στα επεξεργασμένα τρόφιμα και ποτά (π.χ. μπύρα) που χρησιμοποιούν ως πρώτη ύλη το κριθάρι. Η επιμόλυνση με μυκοτοξίνες συντελεί στη σημαντική ποιοτική υποβάθμιση του προϊόντος και των παραγώγων του (π.χ. μπύρα), ενώ η κατανάλωση τέτοιων προϊόντων δύναται να αποτελέσει σοβαρό κίνδυνο για τη δημόσια υγεία. Η παρουσία μυκοτοξινών στους σπόρους του κριθαριού μπορεί να λάβει χώρα σε όλα τα στάδια της παραγωγικής διαδικασίας της καλλιέργειας (καλλιέργεια, συγκομιδή, επεξεργασία, αποθήκευση, διανομή) μέχρι και το στάδιο της ζυθοποιίας. Οι κυριότερες μυκοτοξίνες που εντοπίζονται στην καλλιέργεια του κριθαριού είναι οι τριχοθηκίνες (δεοξυλιβαλενόλη-DON, νιβαλενόλη-NIV, HT-2, T-2) η ζεαραλενόνη (ZEA), οι φουμονισίνες (FUM), οι αφλατοξίνες (AF) και η ωχρατοξίνη Α (ΟΤΑ) και έχουν μελετηθεί εκτενώς λόγω της συχνής παρουσίας τους στα τρόφιμα.Στη χώρα μας ωστόσο, μέχρι στιγμής, δεν υπάρχουν εγκεκριμένα φυτοπροστατευτικά προϊόντα για την αντιμετώπιση των μυκήτων του γένους Aspergillus spp., ενώ για τους μύκητες του γένους Fusarium spp. οι εγκεκριμένες δραστικές ουσίες που επιτρέπονται στο κριθάρι είναι ελάχιστες. Συνεπώς, κρίνεται επιτακτική η ανάγκη για αξιολόγηση διαφόρων φυτοπροστατευτικών προϊόντων ώστε να μελετηθεί η αποτελεσματικότητα των ήδη υπαρχόντων αλλά και νέων δραστικών ουσιών και σκευασμάτων για την καλλιέργεια του κριθαριού.Η κύρια ιδέα για την ανάπτυξη της πρότασης προήλθε από την έλλειψη μιας εμπεριστατωμένης καταγραφής της υφιστάμενης κατάστασης σε αγρούς κριθαριού όσον αφορά τις μυκοτοξίνες που παράγονται από είδη των γενών Aspergillus και Fusarium αλλά και την πληθυσμιακή τους διακύμανση στην καλλιέργεια αυτή, μια ιδιαίτερα σημαντική καλλιέργεια όπου κερδίζει ολοένα και μεγαλύτερο έδαφος στην οικονομία της χώρας, όπως επίσης και για το νέο πρόβλημα της παρουσίας των μυκοτοξινών στη μπύρα. Την ιδέα αυτή ενίσχυσε το γεγονός πως πολλές απομονώσεις μυκήτων των γενών Aspergillus και Fusarium που προήλθαν από σπόρο κριθαριού σε προκαταρκτικά πειράματα, εμφάνισαν εξαιρετικά έντονη τοξικογόνο ικανότητα όταν ελέγχθηκαν με χρωματογραφικές μεθόδους στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών. Δειγματοληψίες στάχεων κριθαριού (2017-2019) από περιοχές της χώρας στις οποίες καλλιεργείται βυνοποιήσιμο ή κτηνοτροφικό κριθάρι οδήγησαν στη δημιουργία συλλογής μυκήτων από σπόρους κριθαριού που αποτελείται από 719 στελέχη του γένους Fusarium και 421 στελέχη του γένους Aspergillus. Τα περισσότερα είδη της συλλογής των Fusarium spp. ανήκουν στα είδη F. proliferatum και F. verticillioides ενώ όσον αφορά την μυκοτοξικογόνο ικανότητά τους, το 35% των απομονώσεων παράγουν τριχοθηκίνες, το 43% φουμονισίνες ενώ το 22% των στελεχών είναι μη-τοξικογόνα. Στους αγρούς οι οποίοι είχαν υψηλή συγκέντρωση φουμονισινών, επικρατούσε ο μύκητας F. verticillioides έναντι άλλων ειδών Fusarium. Όσον αφορά στα αποτελέσματα για το γένος Aspergillus, το ποσοστό των μη-τοξικογόνων στελεχών στους ελληνικούς αγρούς κριθαριού ανήλθε σε 71,26%.Παράλληλα, έγινε αξιολόγηση 10 βυνοποιήσιμων ποικιλιών κριθαριού ως προς την ικανότητά τους να παρεμποδίζουν τη βιοσύνθεση μυκοτοξινών και διαπιστώθηκε ότι οι πιο ανεκτικές ποικιλίες βυνοποιήσιμου κριθαριού στη μόλυνση με το μύκητα F. graminearum και τη βιοσύνθεση δεοξυλιβαλενόλης ήταν οι IRINA, SANGRIA και PLANET, ενώ η πιο ευαίσθητη ήταν η AC, ενώ για το μύκητα A. flavus και τις αφλατοξίνες ως ευαίσθητη αποδείχθηκε η ποικιλία ZHANA και ως η πιο ανεκτική η ποικιλία GRACE. Τα αποτελέσματα αυτά συσχετίστηκαν με την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση των αντίστοιχων μυκοτοξινών.Ακολούθησε αξιολόγηση 4 βιολογικών σκευασμάτων (Botector®, Trianum®, Remedier®, Tusal®) και 5 χημικών σκευασμάτων (Switch®, Quadris®, Neotopsin®, Madison®, Miraculix®) ως προς α) την παρεμπόδιση της κονιδιογένεσης των μυκήτων F. graminearum και A. flavus σε συνθήκες in vitro, β) την ικανότητά τους να μειώνουν την έξαρση των αντίστοιχων ασθενειών και γ) την ικανότητά τους να παρεμποδίζουν τη βιοσύνθεση δεοξυλιβαλενόλης και αφλατοξινών. Τα σκευάσματα που μείωσαν δραστικά την εξέλιξη σοβαρότητας της ασθένειας Fusarium Head Blight ήταν τα Miraculix® και Neotopsin®, ενώ αυτό που μείωσε την εξέλιξη σοβαρότητας σήψεων που οφείλονται στο μύκητα A. flavus ήταν το Switch®. Όσον αφορά στην παρεμπόδιση παραγωγής δεοξυλιβαλενόλης, τα αποτελεσματικότερα χημικά σκευάσματα ήταν τα Neotopsin® και Miraculix® με 93,79% και 97,42% παρεμπόδιση αντίστοιχα, ενώ κανένα βιολογικό σκεύασμα δεν έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα όσον αφορά στη μείωση της δεοξυλιβαλενόλης. Όσον αφορά στη μείωση των αφλατοξινών, το αποτελεσματικότερο βιολογικό σκεύασμα ήταν το Trianum® με 28,65% παρεμπόδιση σε σχέση με το μάρτυρα και το αποτελεσματικότερο χημικό ήταν το Switch® με παρεμπόδιση της τάξης του 90,76%. Επίσης, έγινε απομόνωση διαφόρων ενδοφυτικών και επιφυτικών βακτηρίων και ζυμών από σπόρους κριθαριού και βρέθηκε ότι ενδημικά ενδοφυτικά βακτήρια και ζύμες μείωσαν τις αφλατοξίνες έως και 35% ενώ τη δεοξυλιβαλενόλη έως και 45%. Επίσης, έγινε έλεγχος ανθεκτικότητας απομονώσεων Fusarium spp. και A. flavus σε διάφορες δραστικές ουσίες μυκητοκτόνων (fludioxonil, cyprodinil, boscalid, azoxystrobin, prochloraz, prothioconazole, thiphanate-methyl, trifloxystrobin) και βρέθηκε ότι εντοπίστηκαν αρκετά ανθεκτικά στελέχη στις δραστικές ουσίες azoxystrobin, boscalid και trifloxystrobin.Στη συνέχεια διερευνήθηκε η πορεία της συγκέντρωσης της δεοξυλιβαλενόλης και της αφλατοξίνης καθόλα τα στάδια της βυνοποίησης σε ευαίσθητες και ανθεκτικές ποικιλίες βυνοποιήσιμου κριθαριού και μετά από εφαρμογή αποτελεσματικών βιολογικών και χημικών σκευασμάτων στο κριθάρι σε συνθήκες αγρού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το σκεύασμα Miraculix® οδήγησε σε πλήρη απουσία δεοξυλιβαλενόλης στη μπύρα κατά το τελευταίο στάδιο βυνοποίησης ενώ το σκεύασμα Switch® παρεμπόδισε την μόλυνση με αφλατοξίνες στη μπύρα.Τέλος, από το συνδυασμό όλων των ανωτέρω ευρημάτων, αξιολογήθηκαν στον αγρό ολοκληρωμένα συστήματα διαχείρισης των μυκοτοξινών στο κριθάρι που απέδειξαν πως συνδυάζοντας κατάλληλα τη σωστή ποικιλία βυνοποιήσιμου κριθαριού με την εφαρμογή αποτελεσματικών σκευασμάτων στο στάδιο της άνθισης, ο παραγωγός μπορεί να αντιμετωπίσει αποτελεσματικά τις συγκεκριμένες ασθένειες και μυκοτοξίνες. Συγκεκριμένα, η συνδυαστική εφαρμογή των σκευασμάτων Miraculix® και Trianum® στην ποικιλία ZHANA επέφερε πλήρη παρεμπόδιση βιοσύνθεσης δεοξυλιβανελόλης στο κριθάρι και τη μπύρα ενώ η συνδυαστική εφαρμογή των σκευασμάτων Switch® και Trianum® στην ποικιλία GRACE επέφερε 97,8% παρεμπόδιση βιοσύνθεσης αφλατοξινών στο κριθάρι και τη μπύρα. Καμία αποτελεσματική εφαρμογή δεν επηρέασε τα ποσοτικά (βάρος σπόρου) ή τα ποιοτικά χαρακτηριστικά (περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη) του σπόρου του βυνοποιήσιμου κριθαριού σε επίπεδα που να τον καθιστούν ακατάλληλο προς βυνοποίηση.Στη συγκεκριμένη διατριβή μέσα από τους στόχους που τέθηκαν, δημιουργήθηκε ένα ολοκληρωμένο σύστημα αντιμετώπισης το οποίο θα συμβάλλει στον περιορισμό των απωλειών και στη μειωμένη συγκέντρωση μυκοτοξινών στο τελικό προϊόν και στα επεξεργασμένα τρόφιμα και ποτά που χρησιμοποιούν ως πρώτη ύλη το κριθάρι, αλλά στην απόκτηση νέων δεδομένων στην αντιμετώπιση των φυτοπαθογόνων μυκήτων που προκαλούν σήψη στη συγκεκριμένη καλλιέργεια και ζημιώνουν την αγροτική παραγωγή ποιοτικά και ποσοτικά, συνεισφέροντας παράλληλα σημαντικά στη θεωρητική και εφαρμοσμένη επιστημονική γνώση. Το όφελος που απορρέει επίσης από τη συγκεκριμένη έρευνα κρίνεται ιδιαίτερα σημαντικό καθώς η παραγωγή μπύρας με υψηλά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά και απαλλαγμένη από μυκοτοξίνες θα μπορούσε να διαπιστευτεί περαιτέρω με ειδική σήμανση στην ετικέτα του προϊόντος, προσδίδοντας έτσι σημαντική προστιθέμενη αξία στη μπύρα και να οδηγήσει σε αύξηση της ανταγωνιστικότητας και της εμπορικότητάς της στην ελληνική και διεθνή αγορά.