Κυτταρογενετική, μοριακή και επιγενετική διερεύνηση της χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας

Abstract

Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL), one of the most common forms of hematologic malignancies, is characterized by in vivo accumulation of monoclonal B-lymphocytes in peripheral blood and bone marrow, which infiltrate lymphatic tissues and spleen, often causing inflation of the lymph nodes and dysfunction of the immune system. The disease presents great clinical variation which is intertwined with the diversity observed at genetic and molecular level. Some patients survive for many years without treatment while others suffer from an aggressive form of the disease. The molecular and genetic basis of CLL has not been fully elucidated yet however, genetic and epigenetic mechanisms appear to be present in the pathogenetic pathway of the disease and the large clinical variability that it presents. Cytogenetic findings contribute to the diagnosis, prognosis and selection of the appropriate treatment protocol for CLL patients. Nowadays, in the bone marrow (BM) cell culture of CLL patients we use a combination of B-cell stimulators, such as DSP-30 and interleukin-2 (IL-2) combination, which significantly increase the percentage detection of clonal chromosomal abnormalities, personalizing the prognosis of patients. Molecular analysis has shown alterations in genes whose products regulate important cell functions such as growth, division and proliferation. These changes involve both gene mutations and epigenetic changes. Methylation of cytosines in CpG islands of gene promoters is one of the most studied epigenetic DNA modifications in humans and affects the structure of chromatin as well as the transcriptional activity. Although the investigation of molecular mechanisms in leukemia is currently at the center of research interest, the study of these mechanisms in CLL is still at an early stage. Very recent studies indicate that methylation of DNA is a significant epigenetic modification that is associated with CLL. In this thesis we study methylation of RAD21 gene which is located in the long arm of chromosome 8, chromosomal region 8q24.11. The produced RAD21 protein is one of the basic subunits of the cohesin complex which is involved in the mechanism that controls the correct separation of sister chromatids during cell division and participates in DNA repair mechanisms. Methylation of RAD21 gene promoter leads to transcriptional inactivation and thus gene silencing. Studying methylation of RAD21 gene and associating findings with CLL and its specific cytogenetic alterations may contribute to a better understanding of the pathogenetic course of the disease and also to the design of new therapeutic methods using demethylation agents that are already used in the treatment of other diseases. In addition, studies of CLL patients have shown the involvement of genetic predisposing factors in the onset of the disease. Paroxonases (PONs) are enzymes that protect cells from genotoxic factors such as organophosphates and free oxygen radicals, agents that cause metabolic lesions and DNA damage by contributing to carcinogenicity. PON1 gene (paroxonase 1, a subunit of the paroxonases complex) located on the chromosome region 7q21.3, presents two SNP polymorphisms in its coding region, at positions 55 and 192, which result in the replacement of an amino acid and affect the concentration, stability and activity of the enzyme. In particular, the L55M polymorphism (Leu55Met [rs854560]) involves replacement of leucine (L) by methionine (M) and polymorphism Q192R (Gln192Arg [rs662]) replacing glutamine (Q) by arginine (R). In this dissertation we studied the two polymorphisms of PON1 gene in order to investigate their possible involvement in the genetic predisposition of CLL and the formation of characteristic chromosomal lesions. The purpose of this doctoral thesis is the cytogenetic, molecular and epigenetic study of CLL patients. In particular, the present thesis focuses on investigating the methylation pattern of RAD21 gene promoter and the study of L55M and Q192R polymorphisms of PON1 gene which, in combination with cytogenetic findings, may contribute to the elucidation of the pathogenesis and the mechanisms of the disease.For the purposes of this thesis, 300 bone marrow samples from CLL patients, received at the NCSR Lab "Demokritos" for their cytogenetic analysis were recruited. After BM cell culturing, harvesting and fixation, chromosome banding was performed using GTG banding method. Microscopic and karyotypic analysis was performed using Ikaros software (Metasystems). Karyotypes were described according to the International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN) 2016. In patients deemed necessary, we applied fluorescent in situ hybridization (FISH) method to mesophasic and metaphase cells (FISH interphase and metaphase) using appropriate probes. Studying RAD21 methylation we included 105 CLL patients, selected based on their cytogenetic findings, and 17 healthy donors. Total genomic DNA was isolated from all of CLL patients’ BM samples and from 106 healthy donors’ peripheral blood samples for molecular analysis. Using Real-Time PCR and the EpiTect Methyl II PCR Assay we studied the methylation status of RAD21 gene promoter and then the results were correlated with patients’ cytogenetic findings to investigate possible involvement in the formation of specific CLL abnormalities. In the study of the two polymorphisms of PON1 gene, 300 CLL patients and 106 healthy donors were participated. Genotyping methods using Polymerase Chain Reaction (PCR) and digestion with restriction endonucleases (PCR-RFLPs method) were standardized. For the determination of normal and mutant genotypes electrophoresis in 2% agarose gel was performed. After the distribution of the genotypes and alleles of the polymorphisms the results were associated with patients’ cytogenetic findings. The correlations of all results were examined and compared with the Chi-Square test, χ2. Statistical analysis was performed using SPSS software (Statistical Package for Social Sciences) version 20. The study was based on a 95% confidence interval and a significance level of 5%. Fisher's Exact Test was used where necessary. From the cytogenetic analysis of the 300 CLL patients, 39.3% (118/300) of patients had normal karyotype (confirmed with FISH) and 60.7% (182/300) pathological karyotype. Among the 182 patients with pathological karyotype 33.5% (61/182) had del(13q), 30.8% (56/182) trisomy 12, 21.9% (40/182) del(11q), 13.2% (24/182) del(17p), 11.5% (21/182) of patients had abnormalities in 14q32 region [abn(14q32)], 6.6% (12/182) chromosome 8 alterations [abn(8)], 4.9% (9/182) of patients del(6q) and 12.1% (22/182) of patients had other chromosomal alterations.Concerning RAD21 methylation, this study was successful in 96% of patients and 100% of healthy donors. A statistically higher frequency of methylated samples was observed in patients (25.75%), compared to controls (0%) (p= 0.022). Correlation between RAD21 gene methylation and karyotypic results showed comparable methylation frequency between the different cytogenetic subgroups. Specifically, methylation was observed in 28.57% of patients with normal karyotype and in 25% of patients with pathological karyotype suggesting that methylation of this gene was not associated with chromosomal alterations. This thesis is the first study that examines the methylation of RAD21 gene in patients with CLL.Examining PON1 gene polymorphisms, the Q192R polymorphism study was 100% successful in CLL patients and 98.1% in healthy donors. Genotypic and allele distribution ofQ192R polymorphism showed a statistically significant higher frequency of the mutant genotypes (QR heterozygotes and RR homozygotes) (p=0.028) and the mutant R allele in patients compared to controls (p=0.012). Comparing each karyotypic subgroup of patients with the results of the healthy donors a statistically higher incidence was showed at mutated genotypes and alleles in the pathological karyotype group, specifically in those carrying abn14q32 and del(6q) (p=0.030 and p=0.021 respectively). A statistically increased frequency for the mutant allele was also revealed in patients with del(11q) (p=0.035). The study of L55M polymorphism was 100% successful in CLL patients and 99.1% in healthy donors. But unlike Q192R polymorphism, L55M polymorphism showed similar distributions between patients and controls indicating that L55M polymorphism, in contrast to Q192R polymorphism, does not appear to predispose to the appearance of CLL. In conclusion, this thesis was the first study to investigate the methylation status of RAD21 gene in patients with CLL and showed an increased presence of methylation in CLL patients compared to healthy donors, suggesting a possible pathogenetic role of RAD21 promoter methylation in the development of CLL probably via self-renewal of CLL cells and not via the formation of chromosomal abnormalities. Our results from the study of the two polymorphisms of PON1 gene, indicates a possible role of Q192R polymorphism in CLL predisposition and the formation of specific chromosome aberrations in contrast with L55M polymorphism.

H Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία (ΧΛΛ), μία από τις πιο συχνές μορφές αιματολογικών κακοηθειών, χαρακτηρίζεται από in vivo συσσώρευση μονοκλωνικών Β-λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα και στο μυελό των οστών, τα οποία διηθούν τους λεμφικούς ιστούς και τον σπλήνα προκαλώντας συχνά διόγκωση των λεμφαδένων και δυσλειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος. Η νόσος παρουσιάζει μεγάλη κλινική ετερογένεια η οποία είναι συνυφασμένη με την ετερογένεια που παρατηρείται σε γενετικό και μοριακό επίπεδο. Κάποιοι ασθενείς επιβιώνουν για πολλά χρόνια χωρίς θεραπεία, ενώ άλλοι παρουσιάζουν επιθετική νόσο και μικρή επιβίωση. Η μοριακή και γενετική βάση της ΧΛΛ δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί ως σήμερα, ωστόσο στην παθογενετική πορεία της νόσου και στην μεγάλη κλινική ετερογένεια που παρουσιάζει, φαίνεται να εμπλέκονται γενετικοί και επιγενετικοί μηχανισμοί. Τα κυτταρογενετικά ευρήματα συμβάλλουν καθοριστικά στη διάγνωση, πρόγνωση και επιλογή του κατάλληλου θεραπευτικού πρωτοκόλλου των ασθενών με ΧΛΛ. Σήμερα, στην καλλιέργεια του μυελού των οστών των ασθενών με ΧΛΛ γίνεται προσθήκη ενός συνδυασμού διεγερτών των Β κυττάρων, όπως είναι ο συνδυασμός DSP-30 και ιντερλευκίνης-2 (IL-2), αυξάνοντας έτσι σημαντικά το ποσοστό ανίχνευσης των κλωνικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών, εξατομικεύοντας την πρόγνωση των ασθενών. Η μοριακή ανάλυση έχει αναδείξει αλλαγές σε γονίδια τα προϊόντα των οποίων ρυθμίζουν σημαντικές λειτουργίες των κυττάρων, όπως η αύξηση, η διαίρεση και ο πολλαπλασιασμός τους. Οι αλλαγές αυτές αφορούν τόσο μεταλλάξεις γονιδίων, όσο και επιγενετικές αλλαγές. Η μεθυλίωση των κυτοσινών στις νησίδες CpG υποκινητών γονιδίων είναι μια από τις πιο μελετημένες επιγενετικές τροποποιήσεις του DNA στον άνθρωπο και επηρεάζει τη δομή της χρωματίνης και τη μεταγραφική ενεργότητα των γονιδίων. Αν και η διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών λευχαιμογένεσης βρίσκεται σήμερα στο επίκεντρο του ερευνητικού ενδιαφέροντος, η μελέτη αυτών των μηχανισμών στη ΧΛΛ είναι ακόμα σε πρώιμο στάδιο. Πολύ πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι η μεθυλίωση του DNA είναι μια σημαντική επιγενετική τροποποίηση η οποία σχετίζεται με τη ΧΛΛ. Στην παρούσα διατριβή έγινε μελέτη της μεθυλίωσης του γονιδίου RAD21 το οποίο εδράζεται στα μακρά σκέλη του χρωμοσώματος 8, στη χρωμοσωμική περιοχή 8q24.11. Η παραγόμενη πρωτεΐνη RAD21 αποτελεί μία από τις βασικές υπομονάδες του πρωτεϊνικού συμπλέγματος cohesin που εμπλέκεται στον μηχανισμό που ελέγχει το σωστό διαχωρισμό των αδελφών χρωματίδων και συμμετέχει στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA. Η μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου RAD21 οδηγεί σε μεταγραφική απενεργοποίηση και κατ’ επέκταση γονιδιακή αποσιώπηση. Η μελέτη της μεθυλίωσης του RAD21 και η συσχέτιση των ευρημάτων με την ΧΛΛ και τις ειδικές κυτταρογενετικές αλλοιώσεις της μπορεί να συμβάλει στην καλύτερη κατανόηση της παθογενετικής πορείας της νόσου αλλά και στο σχεδιασμό νέων θεραπευτικών σχημάτων απομεθυλιωτικών παραγόντων που ήδη χρησιμοποιούνται στη θεραπεία διαφόρων άλλων αιματολογικών κακοηθειών. Επιπλέον, μελέτες ασθενών με ΧΛΛ έχουν αναδείξει την συμμετοχή γενετικών προδιαθεσικών παραγόντων στην εμφάνιση της νόσου. Οι παραοξονάσες (PONs) είναι ένζυμα που προστατεύουν τα κύτταρα από γονοτοξικούς παράγοντες όπως τα οργανοφωσφορικά και οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου, παράγοντες που προκαλούν μεταβολικές αλλοιώσεις και βλάβες στο DNA συμβάλλοντας στην καρκινογένεση. Το γονίδιο PON1 (παραοξονάση 1, υπομονάδα του γονιδιακού συμπλέγματος των παραοξωνασών) που εδράζεται στην χρωμοσωματική περιοχή 7q21.3, παρουσιάζει δύο πολυμορφισμούς τύπου SNP στην κωδικοποιούσα περιοχή του, στις θέσεις 55 και 192, που έχουν σαν αποτέλεσμα την αντικατάσταση ενός αμινοξέος και επηρεάζουν τη συγκέντρωση, τη σταθερότητα και την ενεργότητα του ενζύμου. Πιο συγκεκριμένα ο πολυμορφισμός L55M (Leu55Met [rs854560]) αφορά αντικατάσταση λευκίνης (L) από μεθειονίνη (Μ) και ο πολυμορφισμός Q192R (Gln192Arg [rs662]) αντικατάσταση γλουταμίνης (Q) από αργινίνη (R). Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε τους δύο πολυμορφισμούς του γονιδίου PON1, προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή εμπλοκή τους στην γενετική προδιάθεση της ΧΛΛ και στη δημιουργία των χαρακτηριστικών χρωμοσωμικών αλλοιώσεων της. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η κυτταρογενετική, μοριακή και επιγενετική διερεύνηση ασθενών με Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία. Πιο συγκεκριμένα η παρούσα διατριβή επικεντρώνεται στη διερεύνηση του προτύπου μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου RAD21 και τη μελέτη των πολυμορφισμών L55M και Q192R του γονιδίου PON1 που σε συνδιασμό με τα κυτταρογενετικά δεδομένα μπορεί να συμβάλλουν στη διαλεύκανση των μηχανισμών παθογένεσης και προδιάθεσης της νόσου. Για τη συγκεκριμένη διατριβή χρησιμοποιήθηκαν 300 δείγματα μυελού των οστών από ασθενείς με ΧΛΛ που παραλήφθησαν στο Εργαστήριο του ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος» προκειμένου να πραγματοποιηθεί κυτταρογενετική τους ανάλυση. Τα κυττάρα μυελού των οστών καλλιεργήθηκαν, συλλέχθηκαν και μονιμοποίηθηκαν. Μετά από ζωνοποίηση των χρωμοσωμάτων, με τη μέθοδο GTG banding, έγινε μικροσκοπική και καρυοτυπική ανάλυση και τέλος αξιολόγηση των αποτελεσμάτων. Οι καρυότυποι περιγράφηκαν σύμφωνα με το διεθνές σύστημα ονοματολογίας Κυτταρογενετικής ISCN 2016. Σε ασθενείς που κρίθηκε απαραίτητο έγινε εφαρμογή της μεθόδου του Φθορίζοντος in situ Υβριδισμού (FISH) σε μεσοφασικά και μεταφασικά κύτταρα (interphase και metaphase FISH). Από όλα τα δείγματα των ασθενών με ΧΛΛ καθώς και από 106 δείγματα περιφερικού αίματος υγιών δοτών απομόνωθηκε ολικό γενωμικό DNA, προκειμένου στη συνέχεια να πραγματοποιηθεί η μοριακή ανάλυση. Στη μελέτη της μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου RAD21 συμπεριλήφθηκαν 105 ασθενείς με ΧΛΛ, επιλεγμένοι με βάση τα κυτταρογενετικά τους ευρήματα, και 17 υγιείς δότες. Με PCR πραγματικού χρόνου (Real-Time PCR) και τη χρήση του EpiTect Methyl II PCR Assay μελετήθηκε το πρότυπο μεθυλίωσης του γονιδίου RAD21 και ακολούθως τα αποτελέσματα συσχετίστηκαν με τα κυτταρογενετικά ευρήματα των ασθενών ώστε να διερευνηθεί πιθανή εμπλοκή της εν λόγω μεθυλίωσης στο σχηματισμό συγκεκριμένων χρωμοσωμικών αλλοιώσεων της ΧΛΛ. Για την μελέτη των πολυμορφισμών Q192R και L55Mτου γονιδίου PON1, συμμετείχαν 300 ασθενείς με ΧΛΛ και 106 υγιείς δότες. Αφού έγινε προτυποποίηση των μεθόδων γονοτυπικής ανάλυσης για τους δύο πολυμορφισμούς του γονιδίου PON1, η κατανομή των γονοτύπων και των αλληλομόρφων των πολυμορφισμών έγινε μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) και πέψης με περιοριστικές ενδονουκλεάσες για τον προσδιορισμό φυσιολογικών και μεταλλαγμένων γονοτύπων. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με την μέθοδο PCR-RFLPs και με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Μετά την κατανομή των γονοτύπων και των αλληλομόρφων των πολυμορφισμών έγινε συσχέτιση με τα κυτταρογενετικά ευρήματα των ασθενών. Οι συσχετίσεις όλων των αποτελεσμάτων, εξετάστηκαν και συγκρίθηκαν με το στατιστικό µη-παραµετρικό τεστ χ2 (Chi-Square test). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό SPSS (Statistical Package for Social Sciences) έκδοση 20. Ο έλεγχος έγινε βάσει 95% διαστήματος εμπιστοσύνης (95% confidence interval) και επίπεδο σημαντικότητας 5%. Στις περιπτώσεις που ήταν απαραίτητο χρησιμοποιήθηκε και το Fisher’s Exact Test. Κατά την κυτταρογενετική ανάλυση των 300 ασθενών με ΧΛΛ, 39,3% (118/300) των ασθενών είχαν φυσιολογικό καρυότυπο (επιβεβαιωμένο και με FISH) και 60,7% (182/300) παθολογικό καρυότυπο. Μεταξύ των 182 ασθενών με παθολογικό καρυότυπο το 33,5% (61/182) έφεραν del(13q), 30,8% (56/182) τρισωμία 12, 21,9% (40/182) del(11q), 13,2% (24/182) del(17p), 11,5% (21/182) των ασθενών έφεραν αλλοιώσεις της περιοχής 14q32 [abn(14q32)], 6,6% (12/182) αλλοιώσεις του χρωμοσώματος 8 [abn(8)], 4,9% (9/182) των ασθενών del(6q) και 12,1% (22/182) των ασθενών έφεραν άλλες χρωμοσωμικές αλλοιώσεις. Όσον αφορά τη μεθυλίωση του γονιδίου RAD21 η μελέτη αυτή ήταν επιτυχής στο 96% των ασθενών και στο 100% των υγειών δοτών. Στατιστικά σημαντική υψηλότερη συχνότητα μεθυλιωμένων δειγμάτων παρατηρήθηκε στους ασθενείς (25,75%), σε σύγκριση με τους υγιείς δότες (0%) (p=0,022). Η συσχέτιση της μεθυλίωσης με τα κυτταρογενετικά ευρήματα έδειξε παρόμοια αποτελέσματα. Συγκεκριμένα, μεθυλίωση παρατηρήθηκε στο 28.57% των ασθενών με φυσιολογικό καρυότυπο και στο 25% των ασθενών με παθολογικό καρυότυπο υποδικνύοντας ότι η μεθυλίωση του συγκεκριμένου γονιδίου δεν σχετίζεται με τη δημιουργία χρωμοσωμικών αλλοιώσεων. Η παρούσα διατριβή αποτελεί την πρώτη μελέτη μεθυλίωσης του γονιδίου RAD21 σε ασθενείς με ΧΛΛ.Κατά την μελέτη των δύο πολυμορφισμών του γονιδίου PON1, η μελέτη του πολυμορφισμού Q192R ήταν 100% επιτυχής στους ασθενείς με ΧΛΛ και στο 98,1% για τούς υγιείς δότες. Η κατανομή των γονοτύπων και των αλληλομόρφων του πολυμορφισμού αυτού έδειξε στατιστικά σημαντική υψηλότερη συχνότητατων μεταλλαγμένων γονοτύπων (ετεροζυγοτών QR και ομόζυγων RR) (p=0.028) και του μεταλλαγμένου R αλληλομόρφου στους ασθενείς σε σύγκριση με τους υγιείς δότες (p=0.012). Συγκρίνοντας την κάθε καρυοτυπική υποομάδα ασθενών μαζί με τα αποτελέσματα των υγιών δοτών στατιστικά ψηλότερη συχνότητα εμφάνισης των μεταλλαγμένων γονοτύπων και αλληλομόρφων παρατηρείται στην ομάδα των ασθενών με παθολογικό καρυότυπο και συγκεκριμένα αυτών που έφεραν abn14q32 και del(6q) (p=0.030 και p=0.021 αντίστοιχα). Στατιστικά αυξημένη συχνότητα για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο αποκαλύφθηκε επίσης στους ασθενείς με την αλλοίωση del(11q) στον καρυότυπο τους (p=0.035). Η μελέτη του πολυμορφισμού L55M ήταν 100% επιτυχής στους ασθενείς με ΧΛΛ και στο 99,1% για τούς υγιείς δότες. Αντίθετα όμως με τον πολυμορφισμό Q192R, ο πολυμορφισμός L55M έδειξε στατιστικά παρόμοιες κατανομές μεταξύ ασθενών και μαρτύρων υποδεικνύοντας ότι ο πολυμορφισμός L55M σε αντίθεση με τον πολυμορφισμό Q192R, δεν φαίνεται να προδιαθέτει στην εμφάνιση της ΧΛΛ. Συμπερασματικά μπορούμε να πούμε ότι, στη συγκεκριμένη διατριβή έγινε η πρώτη μελέτη διερεύνησης της κατάστασης μεθυλίωσης του γονιδίου RAD21 σε ασθενείς με ΧΛΛ, και έδειξε αυξημένη παρουσία μεθυλίωσης στους ασθενείς με ΧΛΛ σε σχέση με τους υγιείς δότες, υποδεικνύοντας πιθανή συμετοχή της μεθυλίωσης του γονιδίου RAD21 στην παθογένεση της ΧΛΛ πιθανόν μέσω αυτοανανέωσης των κυττάρων της ΧΛΛ και όχι μέσω του σχηματισμού χρωμοσωμικών αλλοιώσεων. Τα αποτελέσματά μας από την μελέτη των δύο πολυμορφισμών του γονιδίου PON1, ενισχύουν τον πιθανό ρόλο του πολυμορφισμού Q192R στην προδιάθεση της ΧΛΛ και στη δημιουργία συγκεκριμένων χρωμοσωμικών αλλοιώσεων της νόσου, σε αντίθεση με τον πολυμορφισμό L55M.