Κυτταρογενετική μελέτη των μη hodgkin λεμφωμάτων στην παιδική και εφηβική ηλικία: συσχέτιση με αιτιοπαθογένεια και έκβαση

Abstract

Pediatric non-Hodgkin lymphomas (NHLs) comprise approximately 10% of all childhood cancers, are a diverse collection of lymphoid malignancies with varied pathologies, cells of origin, natural history, and response to treatment. There are four major pathologic subtypes of pediatric NHL : Burkitt lymphomas (BL), diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), anaplastic large cell lymphoma (ALCL) and lymphoblastic lymphomas (LBL). The diagnosis of pediatric NHL requires an extensive workup with multiple ancillary studies such as immunophenotyping by flow cytometry or immunohistochemistry, genetic or molecular analysis. Progress in this area over the past 20 years has defined structural chromosomal abnormalities, including translocations, deletions, inversions, amplifications, which alter critical genes that are associated with the development of NHL. With the currently available molecular methods, genetic abnormalities of various types can be identified in all cases of NHL. Genetic testing using fluorescence in situ hybridization (FISH) is another cytogenetic approach that is often utilized in pediatric NHL. FISH technology uses specific, fluorescently labeled DNA probes to identify specific chromosomal abnormalities. This approach is useful because it is much more rapid compared with conventional cytogenetics. Our study included 146 children (113 boys-33 girls), aged 0,33-17,8 years (median 9,16 years), with NHL diagnosed based on histopathology. Seventy-two (72) patients were histologically classified as BL, 9 patients as DLBCL, 48 patients as LL (32 patients B-LL and 16 patients T-LL), 12 patients as ALCL, 2 patients as PTLD, 2 patients as Follicular lymphoma and 1 patient as Marginal zone lymphoma. Based on clinical staging systems 1 patient was classified as stage I (Marginal zone Lymphoma patient), 36 patients as stage II (15 patients with BL, 5 patients with DLBCL, 15 patients with LL and 1 patient with FL), 80 patients as stage III (45 patients with BL, 3 patients with DLBCL, 25 patients with LL and 7 patients with ALCL), while 28 patients had stage IV disease at diagnosis (12 patients with BL, 1 patient with DLBCL, 8 patients with LL, 5 patients with ALCL and 2 patients with PTLD). Bone Marrow involvement was found in 25 patients and CNS infiltration in 6 patients. Combined Bone Marrow Involvement and CNS Infiltration had 5 patients. In total, 12 patients underwent Hematopoietic Stem Cell Transplantation (HSCT): 9 patients underwent autologous HSCT in CR2 due to relapse and 5 patients underwent allogeneic HSCT (2 in CR2 due to relapse and 3 in CR3 due to relapse after allogeneic HSCT). The histological diagnosis was based on the complete microscopic and immunohistochemical study of infiltrated solid tissues (mainly lymph nodes, but also extra-lymph nodes). In all patients with bone marrow infiltration, a conventional cytogenetic study was performed with the application of G banding technique.Touch imprints from the diagnostic biopsy samples were investigated with i-FISH. In BL, DLBCL and PTLD, rearrangements of the genes: MYC (8q24), BCL6 (3q27), BCL2 (18q21), IGH (14q32), IGK (2p11), and IGL (22q11) was performed. In B-LL cases the presence of reciprocal chromosomal translocations: t(12;21)(p13;q22), and t(9;22)(q34;11), rearrangement of the KMT2A (MLL;11q23) and TCF3 (19p13) genes (and, on a positive result, the presence of the reciprocal chromosomal trasnlocation t(1;19)(q23;p13), the level of presentation of the sex chromosomes (X, Y) was performed. In T-LL the following investigations were performed: the presence of the reciprocal chromosomal traslocation t(9;22)(q34;q11), the rearrangement of the KMT2A genes (MLL; 11q23), TLX1 (10q24), TLX3 (5q35), the level of presentation of sex chromosomes (X, Y). In cases of ALCL, the following were performed: the rearrangement of the ALK (2p23), MYC (and, on a positive result, rearrangement of the IGH, IGK and IGL genes, as well as the presence of the reciprocal chromosomal translocation t(8;14)(q24; q32). In FL cases, the following were performed: rearrangement of the BCL2 gene (and, positively, rearrangement of the IGH, IGK and IGL genes, as well as the presence of the reciprocal chromosomal translocation t (14; 18) (q32; q21). In MZL cases, the following were performed: the presence of trisomy on chromosome 3 and the rearrangement of the MALT1 gene (18q21). In all cases (regardless of histological diagnosis) the following were performed: numerical atypia of chromosomes 7, 9 and 17 and the level of representation of chromosomal regions 7q31, 9p21, 13q14 and 13q34, 17p13 and 1q21 and 1p32.Deviations from the diploid status were further investigated for aneusomies of the carrier chromosome with the use of appropriate chromosome enumeration probes. So,it was possible to detect numerical atypia for chromosomes 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 17, 18, X and Y, depending on the histological type of lymphoma. Cases in the presence of at least three supernumerary chromosomes, without any evidence of monosomy, were considered hyperdiploid. With a median follow-up time of 61.5 months (range 7-123 months), a total of 20 patients relapsed and succumbed, yielding: 3-year and 5-year progression free survival (PFS) in all patients 84.5% και 82.5% respectively, and 3-year and 5-year PFS per distinct histological subtype: B-LBL: 90.6% and 87.5%, T-LBL: 68.8% and 68.8%, BL: 88.9% and 88.9%, ALCL: 58.3% and 58.3%, DLBCL 88.9% and 88.9%,FL 100%,MZL 100% and 3-year and 5-year overall survival (OS) in all patients 86.7% and 3-year and 5-year overall survival per distinct histological subtype: B-LBL 90.6%, T-LBL 68.9%, BL 88.9%, ALCL 91.7%, DLBCL 88.9%. 86.7%, FL 100%,MZL 100%. This extensive FISH investigation on imprints of affected tissue provides clinically meaningful information on the genetic profile and may prove valuable in the management of patients with no karyotype available. In particular, the demonstration of hyperdiploidy using chromosome enumeration probes in Burkitt lymphoma patients, could offer the means for the delineation of clonal evolution pathways and the recognition of a subgroup of children with excellent prognosis who could be benefit with low-intensity chemotherapy regimens.

Τα παιδιατρικά μη Hodgkin λεμφώματα αποτελούν περίπου το 10% όλων των καρκίνων της παιδικής ηλικίας. Είναι ετερογενής ομάδα λεμφικών νεοπλασιών και η αντιμετώπιση των ασθενών είναι μια πολύπλοκη διαδικασία στρατηγικής. Υπάρχουν τέσσερις κύριοι παθολογικοί υποτύποι παιδιατρικού NHL: το λέμφωμα Burkitt (BL), το διάχυτο λέμφωμα από μεγάλα Β-λεμφοκύτταρα (DLBCL), το αναπλαστικό λέμφωμα από μεγάλα λεμφοκύτταρα (ALCL) και το λεμφοβλαστικό λέμφωμα (LBL). Η διάγνωση των NHL βασίζεται στον ανοσοφαινότυπο, στην ανοσοϊστοχημεία και στην γενετική ή μοριακή ανάλυση του βιοπτικού υλικού. Τα τελευταία 20 χρόνια έχει σημειωθεί μεγάλη πρόοδος στην κατανόηση της βιολογίας των NHL, η οποία έχει ορίσει δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες, συμπεριλαμβανομένων μετατοπίσεων, ελλειμμάτων, αναστροφών, ενισχύσεων, οι οποίες μεταβάλλουν κρίσιμα γονίδια που σχετίζονται με την ανάπτυξη των NHL. Οι τρέχουσες εξελίξεις της μοριακής βιολογίας πιθανόν να τελειοποιήσουν τις κατατάξεις με αναγνώριση νέων οντοτήτων και ομογενοποίηση των υποτύπων των NHL . Ο γενετικός έλεγχος με χρήση τον in In-Situ Υβριδισμό με Φθορίζοντες Ιχνηθέτες (FISH) είναι μια άλλη κυτταρογενετική προσέγγιση που χρησιμοποιείται συχνά στην μελέτη των NHL. Αυτή η προσέγγιση είναι χρήσιμη επειδή είναι πολύ πιο γρήγορη σε σύγκριση με τη μέθοδο της συμβατικής κυτταρογενετικής. Στη μελέτη μας συνπεριλήφθηκαν 146 ασθενείς με λέμφωμα NHL (113 αγόρια, 33 κορίτσια), ηλικίας 0,33 -17,8 ετών (διάμεση ηλικία διάγνωσης 9,16 έτη). Εβδομήντα δύο (72) ασθενείς ταξινομήθηκαν ιστολογικά ως BL, 9 ασθενείς ως DLBCL, 48 ασθενείς ως LL (32 ασθενείς Β-ΛΛ και 16 ασθενείς Τ-ΛΛ), 12 ασθενείς ως ALCL, 2 ασθενείς ως PTLD, 2 ασθενείς ως Οζώδες λέμφωμα και 1 ασθενής ως λέμφωμα Οριακής ζώνης. Με βάση τα κλινικά συστήματα σταδιοποίησης 1 ασθενής ταξινομήθηκε ως στάδιο I (ασθενής με λεμφωμα Οριακής ζώνης), 36 ασθενείς ως στάδιο II (15 ασθενείς με BL, 5 ασθενείς με DLBCL, 16 ασθενείς με ΛΛ και 1 ασθενής με FL), 80 ασθενείς ως στάδιο III (45 ασθενείς με BL, 3 ασθενείς με DLBCL, 25 ασθενείς με ΛΛ και 7 ασθενείς με ALCL), ενώ 28 ασθενείς παρουσίαζαν νόσο σταδίου IV κατά τη διάγνωση (12 ασθενείς με BL, 1 ασθενής με DLBCL, 8 ασθενείς με ΛΛ, 5 ασθενείς με ALCL και 2 ασθενείς με PTLD). Μυελική συμμετοχή διαπιστώθηκε σε 25 ασθενείς και διήθηση ΚΝΣ σε 6 ασθενείς. Συνδυασμένη Μυελική συμμετοχή και Διήθηση ΚΝΣ είχαν 5 ασθενείς. Συνολικά, 12 ασθενείς υπεβλήθησαν σε Μεταμόσχευση Αρχέγονων Αιμιποιητικών Κυττάρων (MAAK): 9 ασθενείς σε αυτόλογη ΜΑΑΚ σε CR2 λόγω υποτροπής και 5 ασθενείς υπεβλήθησαν σε αλλογενή ΜΑΑΚ ( 2 σε CR2 λόγω υποτροπής και 3 σε CR3 λόγω υποτροπής μετά από αλλογενή ΜΑΑΚ). Η ιστολογική διάγνωση βασίσθηκε στην πλήρη μικροσκοπική και ανοσοϊστοχημική μελέτη διηθημένων συμπαγών ιστών (κυρίως λεμφαδένων, αλλά και εξωλεμφαδενικών εστιών). Σε όλους τους ασθενείς με διήθηση του μυελού των οστών, πραγματοποιήθηκε συμβατική κυτταρογενετική μελέτη με εφαρμογή χρωστικών ανάδειξης των χρωμοσωμικών ζωνών τύπου G (G banding). Σε όλες τις περιπτώσεις πραγματοποιήθηκε έλεγχος με μεσοφασικό FISH επί εντυπωμάτων διηθημένης εστίας της νόσου. Για τους σκοπούς της μελέτης οι έλεγχοι i-FISH που πραγματοποιήθηκαν διακρίθηκαν σε «ειδικούς», δηλαδή καθοριζόμενους από την ιστολογική διάγνωση, και «μη ειδικούς», δηλαδή κοινούς για όλες τις κατηγορίες των λεμφωμάτων. Σε περιπτώσεις BL, DLBCL και PTLD αναζητήθηκαν αναδιατάξεις των γονιδίων: MYC (8q24), BCL6 (3q27), BCL2 (18q21), IGH (14q32), IGK (2p11), και IGL (22q11). Σε περιπτώσεις B-LL αναζητήθηκε η παρουσία της αμοιβαίας χρωμοσωμικής μετάθεσης t(12;21)(p13;q22), t(9;22)(q34;q11), αναδιάταξη των γονιδίων KMT2A (ΜLL; 11q23) και TCF3 (19p13) (και, επί θετικού αποτελέσματος, η παρουσία της αμοιβαίας χρωμοσωμικής μετάθεσης t(1;19)(q23;p13), το επίπεδο εκπροσώπησης των φυλετικών χρωμοσωμάτων (Χ,Υ). Σε περιπτώσεις Τ-LL αναζητήθηκαν: η παρουσία της αμοιβαίας χρωμοσωμικής μετάθεσης t(9;22)(q34;q11), η αναδιάταξη των γονιδίων KMT2A (ΜLL; 11q23), TLX1 (10q24), TLX3 (5q35), το επίπεδο εκπροσώπησης των φυλετικών χρωμοσωμάτων (Χ,Υ). Σε περιπτώσεις ΑLCL αναζητήθηκαν: αναδιάταξη των γονιδίου ALK (2p23), MYC (και, επί θετικού αποτελέσματος, αναδιάταξη των γονιδίων IGH, IGK και IGL, καθώς και η παρουσία της αμοιβαίας χρωμοσωμικής μετάθεσης t(8;14)(q24;q32). Σε περιπτώσεις FL αναζητήθηκαν: αναδιάταξη του γονιδίου BCL2 (και, επί θετικού αποτελέσματος, αναδιάταξη των γονιδίων IGH, IGK και IGL, καθώς και η παρουσία της αμοιβαίας χρωμοσωμικής μετάθεσης t(14;18)(q32;q21). Σε περιπτώσεις MZL αναζητήθηκαν: η παρουσία τρισωμίας του χρωμοσώματος 3 και η αναδιάταξη του γονιδίου MALT1 (18q21). Σε όλες τις περιπτώσεις (ανεξάρτητα από την ιστολογική διάγνωση) αναζητήθηκαν: αριθμητικές ατυπίες των χρωμοσωμάτων 7, 9 και 17 και το επίπεδο εκπροσώπησης των χρωμοσωμικών περιοχών 7q31, 9p21, 13q14 και 13q34, 17p13 και 1q21 και 1p32. Επί παρουσίας οποιασδήποτε διαμόρφωσης σημάτων δηλωτικής απόκλισης από την διπλοειδική κατάσταση έγινε αναζήτηση αριθμητικής ατυπίας του αντιστοίχου χρωμοσώματος. Με αυτόν τον τρόπο, ήταν δυνατή η αξιόπιστη ανίχνευση αριθμητικής ατυπίας για τα χρωμοσώματα 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 17, X και Υ, ανάλογα με τον ιστολογικό τύπο του λεμφώματος. Υπερδιπλοειδικές θεωρήθηκαν οι περιπτώσεις επί παρουσίας τουλάχιστον τριών υπεράριθμων χρωμοσωμάτων, χωρίς οποιαδήποτε ένδειξη μονοσωμίας. Με διάμεσο χρόνο παρακολούθησης 61,5 μήνες (εύρος 7-119 μήνες) υποτροπίασαν συνολικά 20 ασθενείς και κατέληξαν, αποδίδοντας έτσι για το σύνολο των ασθενών 3ετή και 5ετή επιβίωση ελεύθερη συμβαμάτων (PFS) 84.5% και 82.5% αντίστοιχα και ανά ιστολογικό τύπο: B-LBL: 90.6% και 87.5%, T-LBL: 68.8% και 68.8%, BL: 88.9% και 88.9%, ALCL: 58.3% και 58.3%, DLBCL 88.9% και 88.9%. Ως προς την συγκεκριμένη παράμετρο, η έκβαση για τα T-LBL και ALCL αποδείχθηκε κατώτερη ως προς τους άλλους τύπους λεμφώματος σε βαθμό σημαντικά σημαντικό. Για το σύνολο των ασθενών η 3ετής και 5ετής συνολική επιβίωση (OS) ήταν 86.7% και η 3ετής και 5ετής συνολική επιβίωση ανά διακριτό ιστολογικό υπότυπο ήταν B-LBL 90.6%, T-LBL 68.9%, BL 88.9%, ALCL 91.7%, DLBCL 88.9%. Η διαφοροποίηση της OS ανά ιστολογικό τύπο δεν αποδείχθηκε στατιστικά σημαντική. Ωστόσο, από τις παρατηρήσεις επί της συγκεκριμένης ομάδας ασθενών (και, ειδικότερα, από την πλήρη ταύτιση 3ετούς και 5ετούς OS), προκύπτει ότι καθοριστικό διάστημα για την τελική έκβαση (επιβίωση ή θάνατος) είναι οι πρώτοι 36 μήνες από την διάγνωση και ότι ακόμη και οι ασθενείς με όψιμη υποτροπή έχουν καλύτερες προοπτικές σε σχέση με όσους υποτροπιάζουν πρώιμα, δηλαδή εντός της πρώτης τριετίας. Η παρούσα εκτεταμένη έρευνα με i-FISH παρέχει κλινικά σημαντικές πληροφορίες για το γενετικό προφίλ των NHL στον παιδιατρικό πληθυσμό και μπορεί να αποδειχθεί πολύτιμη για ασθενείς χωρίς διαθέσιμο καρυότυπο κατά την διάγνωση.Εν προκειμένω, από τις παρατηρήσεις επί της συγκεκριμένης ομάδας ασθενών με λέμφωμα Burkitt,προκύπτει ότι η υπερδιπλοειδία αποτελεί συχνό φαινόμενο στη παιδική ηλικία και πιθανώς αντιπροσωπεύει μία διακριτή οδό κλωνικής εξέλιξης της τυπικής, t(8;14)+νόσου. Δεδομένου ότι δεν φαίνεται να σχετίζεται με άλλες χρωμοσωμικές βλάβες υψηλού κινδύνου, ενδεχομένως να αποτελεί δείκτη ευνοϊκής πρόγνωσης.