Διερεύνηση των παραγόντων κινδύνου μόλυνσης με Cryptosporidium spp. και γενοτύπησή του σε εκτροφές μικρών μηρυκαστικών

Abstract

The aim of the present study was to identify the distribution of Cryptosporidium species and C. parvum subtypes in pre-weaned lambs and goat kids with diarrhea and to investigate and analyze the potential risk factors for Cryptosporidium spp. infection in small ruminants in Greece. For genotyping and subtyping of Cryptosporidium spp., a total of 580 fecal specimens were collected from 65 farms of small ruminants (39 sheep and 26 goat farms). They were examined for Cryptosporidium oocysts using microscopy of fecal smears strained by the modified Ziehl-Neelsen technique. Microscopy positive specimens from 39 lambs and 41 goat kids were sent to the Centers for Disease Controls and Prevention (CDC), Atlanta, USA for molecular characterization of Cryptosporidium spp. In our study, for the distribution of Cryptosporidium species, the 80 microscopy-positive specimens were examined by PCR analysis of the SSU rRNA gene and 16 specimens from lambs and 17 from goat kids generated the expected PCR products. RFLP analysis of the PCR products identified C. parvum in 16 lambs and 16 goat kids and C. xiaoi in one goat kid.For the distribution of C. parvum subtypes, sequence analysis of the gp60 PCR products identified the presence of seven C. parvum subtypes, including IIdA15G1 (in 8 goat kids and 1 lamb), IIaA20G1R1 (in 5 lambs and 2 goat kids), IIaA15G2R1 (in 4 lambs and 2 goat kids), IIdA16G1 (in 3 lambs), IIdA23G1 (in 2 goat kids), IIaA14G2R1 (in 1 goat kid) και IIdA14G2 (in 1 goat kid). Four C. parvum positive specimens (from 3 lambs and 1 goat kid) did not produce the expected PCR product at the gp60 locus. For the investigation of potential risk factors, standardized questionnaires with information about data of management practices, demographic and hygienic factors were systematically collected (flock size, breed, disinfection, antiparasitic treatments, climate, humidity, presence of diarrhea, etc.). The questionnaires were tested on 59 farms of small ruminants (35 sheep and 24 goat farms). In addition, we chose 22 factors which potentially associated with the risk of C. parvum infection in sheep and goats farms. The results of statistical analysis showed that 2 risk factors (p≤0.05) were associated with the occurrence of cryptosporidiosis prevalence in goat herds and sheep flocks (farm-level), the stagnant water in farm and the percentage of kids/lambs with diarrhea, the time of visit. Sheep and goat farms with presence of stagnant water were 11.78 times more likely to be infected with Cryptosporidiosis compared with farm had no stagnant water on farm. Also, farms that had more than 25% of their animals suffered from diarrhea were 17.39 more times more likely to be infected with Cryptosporidiosis compared with farms contained animals with equal or less than 25% of their animals with diarrhea.

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν: i) η γενοτύπηση και η ταυτοποίηση των ειδών και στελεχών Cryptosporidium που εμπλέκονται στο διαρροϊκό σύνδρομο των αμνών και εριφίων και ii) η διερεύνηση των παραγόντων επικινδυνότητας της μόλυνσης με Cryptosporidium spp. σε εκτροφές μικρών μηρυκαστικών. Με σκοπό τη γενοτύπηση και την ταυτοποίηση των ειδών και στελεχών του που εμπλέκονται στο διαρροϊκό σύνδρομο αμνών και εριφίων συλλέχθηκαν συνολικά 580 δείγματα κοπράνων από 65 εκτροφές μικρών μηρυκαστικών. Από αυτές, 39 (60%) ήταν εκτροφές προβάτων και 26 (40%) ήταν εκτροφές αιγών. Η μέθοδος επιλογής που εφαρμόστηκε για την ανεύρεση ωοκύστεων Cryptosporidium spp. στα δείγματα κοπράνων ήταν η τροποποιημένη Ζiehl-Neelsen (Henriksen and Pohlenz, 1981). Τα 80 πρώτα θετικά δείγματα στάλθηκαν στις Η.Π.Α. (Division of Parasitic Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, 4770 Buford Highway, Atlanta, USA), όπου με την εφαρμογή μοριακών τεχνικών έγινε γενοτύπηση και ταυτοποίηση των ειδών και στελεχών Cryptosporidium. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι 16 δείγματα κοπράνων αμνών και 17 δείγματα κοπράνων εριφίων βρέθηκαν θετικά στην PCR για τα Cryptosporidium spp. Στη συνέχεια, με την RFLP ανάλυση ταυτοποιήθηκαν δύο διαφορετικά είδη του παρασίτου, το C. parvum σε 16 ερίφια και 16 αμνούς και το C. xiaoi σε ένα ερίφιο. Σχετικά με την ταυτοποίηση των στελεχών Cryptosporidium spp. ανευρέθησαν επτά υπότυποι C. parvum με την εξής κατανομή: IIdA15G1 (σε 8 ερίφια και 1 αμνό), IIaA20G1R1 (σε 5 αμνούς και 2 ερίφια), IIaA15G2R1 (σε 4 αμνούς και 2 ερίφια), IIdA16G1 (σε 3 αμνούς), IIdA23G1 (σε 2 ερίφια), IIaA14G2R1 (σε 1 ερίφιο) και IIdA14G2 (σε 1 ερίφιο). Σε τέσσερα θετικά δείγματα με τη μέθοδο nested PCR (από τέσσερις αμνούς και ένα ερίφιο) δεν έγινε ταυτοποίηση υπότυπων C. parvum, λόγω ανεπιτυχούς αλληλούχισης του DNA των τμημάτων που προέκυψαν από την PCR για το gp60 γονίδιο. Με σκοπό τη διερεύνηση των παραγόντων επικινδυνότητας της μόλυνσης με ωοκύστεις Cryptosporidium spp. στις εκτροφές μικρών μηρυκαστικών συντάχθηκε ένα ειδικά δομημένο ερωτηματολόγιο με στόχο τη συλλογή πληροφοριών αναφορικά με διάφορα στοιχεία των εξεταζόμενων εκτροφών (αριθμός ζώων, φυλή, διαχείριση ενηλίκων ζώων, αμνών και εριφίων, απολυμάνσεις, αποπαρασιτισμοί, κλίμα, υγρασία, ηλιοφάνεια, κ.α.). Δεδομένα συλλέχθηκαν από 59 εκτροφές μικρών μηρυκαστικών, εκ των οποίων οι 35 ήταν εκτροφές προβάτων και οι 24, εκτροφές αιγών. Ακολούθως, έγινε επιλογή 22 παραμέτρων, που θεωρήσαμε ότι μπορεί να σχετίζονται περισσότερο ως προς την επικινδυνότητα της μόλυνσης των ζώων με ωοκύστεις του παρασίτου και οι οποίες επεξεργάστηκαν στατιστικά με το στατιστικό πρόγραμμα SPSS 2019, έκδοση 25 (SPSS Corp., IBM, Armonk., NY, USA). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της στατιστικής επεξεργασίας οι παράγοντες επικινδυνότητας που βρέθηκαν στατιστικά σημαντικοί (p≤0,05) ως προς τη μόλυνση των ζώων με το παράσιτο στις εκτροφές μικρών μηρυκαστικών (επίπεδο εκτροφής) ήταν οι εξής: η παρουσία υδατοσυλλογών στις εκτροφές και το ποσοστό των αμνών και εριφίων με διάρροια τη στιγμή της επίσκεψης. Ειδικότερα, οι εκτροφές προβάτων και αιγών με υδατοσυλλογές είχαν 11,78 φορές περισσότερη πιθανότητα να μολυνθούν με το παράσιτο σε σχέση με τις εκτροφές που δεν είχαν υδατοσυλλογές και οι εκτροφές μικρών μηρυκαστικών όπου το ποσοστό διάρροιας για τους αμνούς και τα ερίφια ήταν μεγαλύτερο του 25% , είχαν 17,39 φορές περισσότερη πιθανότητα να μολυνθούν με το παράσιτο συγκριτικά με εκτροφές όπου το ποσοστό των αμνών και των εριφίων με διάρροια ήταν ίσο ή μικρότερο του 25%.