Μελέτη μεθυλίωσης του DNA σε παιδιά και εφήβους με σακχαρώδη διαβήτη τύπου Ι

Abstract

Introduction: Insulin (INS) and protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22 (PTRN22) are the most important genes, after the major histocompatibility complex (MHC), involved in type 1 diabetes (T1D). HLA-G gene belongs to MHC and is one of the relatively recent genes found to be involved in the pathogenesis of T1D. To date, methylation of INS gene promoter studies report conflicting findings: most of the data reported hypomethylation, while in some protocols hypermethylation was found. Regarding PTPN22 and HLA-G genes, no studies have been reported to date on the methylation of the promoter region of these genes in T1D. Aim: The aim of the present study is to investigate the methylation status of INS, PTPN22 and HLA-G gene promoter in children and adolescents with T1D. Material and methods: A total of 40 children and adolescents, 20 with Τ1D (mean duration of T1D 6.15 ± 4.12 years) and 20 healthy controls of the same age and sex, constituted the study population. Genetic material of the study population was isolated from total peripheral blood, modified and analyzed by polymerase chain reaction (PCR) method, libraries were constructed and finally followed by next generation sequencing technique (Next Generation Sequencing – NGS). The profile of the methylation rate at 10, 4, and 19, respectively, distinct cytosine-guanine (CpGs) sites around the transcriptional initiation site (TSS) of the INS, PTPN22, and HLA-G gene promoter genes were recorded as mean ± standard deviation. Results: The overall mean methylation of the children and adolescents of the T1D group did not differ from that of the healthy controls in all the positions studied. However, for the INS gene a statistically significant difference between the two groups was recorded at position -345, where patients with T1D showed hypermethylation compared to healthy controls (p=0.02), while a statistically significant trend of hypermethylation was recorded at -102 in the T1D group compared to healthy controls (p=0.06). In the 4 CpG sites of the PTPN22 gene promoter, statistically significant hypomethylation was found at position 148 (p=0.026), while at position +44 (p=0.065) there was a tendency for statistically significant hypomethylation in the patient group compared with the control group. Finally, the methylation profile of the HLA-G promoter did not show significant differences in the methylation status at the sites of its promoter region in the patient group compared with the control group. Conclusions: In the present study children and adolescents with T1D exhibited increased methylation in distinct positions of the INS gene promoter, hypomethylation in the PTPN22 gene promoter and absence of difference in the methylation status of the HLA-G gene promoter around TSS. These data verified by additional studies could be used as potential biomarkers to identify a possible methylation pattern associated with the onset of T1D in genetically predisposed individuals.

Εισαγωγή: Το γονίδιο της ινσουλίνης (INS) και της της πρωτεϊνικής τυροσινικής φωσφατάσης μη υποδοχέα τύπου 22 (ΡΤΡΝ22) αποτελούν τα σημαντικότερα, μετά το μείζον σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας (MHC), γονίδια που εμπλέκονται στην παθογένεια του σακχαρώδη διαβήτη τύπου 1 (ΣΔ1). Το γονίδιο HLΑ-G ανήκει στο MHC και είναι ένα από τα σχετικά πρόσφατα γονίδια που βρέθηκε ότι εμπλέκονται στην παθογένεια του ΣΔ1. Μέχρι σήμερα, μελέτες του επιπέδου μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου της ΙΝS αναφέρουν αντικρουόμενα ευρήματα: η πλειονότητα των δεδομένων ανέφερε υπομεθυλίωση, ενώ σε κάποια πρωτόκολλα διαπιστώθηκε υπερμεθυλίωση. Όσον αφορά στα γονίδια PTPN22 και HLA-G δεν αναφέρονται εως σήμερα μελέτες στη μεθυλίωση του υποκινητή των γονιδίων αυτών στον ΣΔ1. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της κατάστασης της μεθυλίωσης του υποκινητή των γονιδίων ΙΝS, PTPN22 και HLA-G σε παιδιά και εφήβους με ΣΔ1. Υλικό και μέθοδοι: Συνολικά 40 παιδιά κι έφηβοι, 20 με ΣΔ1 (μέση διάρκεια νόσου 6,15±4,12 έτη) και 20 υγιείς ίδιας ηλικίας και φύλου, αποτέλεσαν τον πληθυσμό της μελέτης. Το γενετικό υλικό του πληθυσμού απομονώθηκε από ολικό περιφερικό αίμα, τροποποιήθηκε και αναλύθηκε με τη μέθοδο της αλυσωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), κατασκευάστηκαν βιβλιοθήκες και τελικά αλληλουχήθηκε με την τεχνική της αλληλούχισης επόμενης γενιάς (Next Generation Sequencing). Το προφίλ του ποσοστού της μεθυλίωσης σε 10, 4 και 19 αντίστοιχα διακριτές θέσεις κυτοσίνης-γουανίνης (CpGs) γύρω από τη θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS) του υποκινητή των γονιδίων INS, PTPN22 και HLA-G καταγράφηκε ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. Αποτελέσματα: Η συνολική μέση μεθυλίωση στα υπό εξέταση γονίδια των παιδιών κι εφήβων της ομάδας του ΣΔ1 δεν διέφερε συγκριτικά με αυτή των υγιών στο σύνολο των θέσεων που μελετήθηκαν. Ωστόσο, στο γονίδιο της INS στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων καταγράφηκε στη θέση -345, όπου οι ασθενείς με ΣΔ1 παρουσίασαν υπερμεθυλίωση συγκριτικά με τους υγιείς (p=0.02), ενώ στατιστικώς σημαντική τάση υπερμεθυλίωσης καταγράφηκε και στην θέση -102 στην ομάδα του ΣΔ1 συγκριτικά με τους υγιείς (p=0.06). Στις 4 CpG θέσεις του υποκινητή του γονιδίου PTPN22 βρέθηκε στατιστικά σημαντικά υπομεθυλίωση στη θέση - 148 (p=0.026), ενώ στη θέση +44 (p=0.065) καταγράφηκε τάση για στατιστικά σημαντική υπομεθυλίωση στην ομάδα των ασθενών σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Τέλος, το προφίλ μεθυλίωσης του υποκινητή του HLA-G δεν παρουσίασε σημαντικές διαφορές όσον αφορά στην κατάσταση μεθυλίωσης στις θέσεις του υποκινητή του στην ομάδα των ασθενών σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Συμπεράσματα: Σε παιδιά κι εφήβους με ΣΔ1 καταγράφεται αυξημένη μεθυλίωση σε διακριτές θέσεις του υποκινητή του γονιδίου της INS, υπομεθυλίωση στον υποκινητή του γονιδίου PTPN22, ενώ δεν καταγράφκε στη μελέτη μας διαφορά στη μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου HLA-G γύρω από το TSS. Tα δεδομένα αυτά, επιβεβαιωμένα από πρόσθετες μελέτες θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν ως δυνητικοί βιοδείκτες για την αναγνώριση πιθανού μοτίβου μεθυλίωσης που σχετίζεται με την εμφάνιση ΣΔ1 σε γενετικά προδιαθετειμένα άτομα.