Κυτταρική βιολογία του σήματος των γλυκοκορτικοειδών: in vitro μελέτες

Abstract

In humans, glucocorticoids (GCs) regulate a broad spectrum of physiologic functions and exert both genomic and nongenomic actions through their ubiquitously expressed glucocorticoid receptor (hGR). The rapid nongenomic actions of GCs are likely to be mediated by membrane hGRs that transduce the glucocorticoid signal via activation of kinases. S-palmitoylation plays an important role in plasma membrane localization and occurs through a highly conserved 9 amino acid motif in the ligand-binding domain (LBD) of steroid receptors. A highly homologous sequence (663YLCMKTLLL671) is present in the LBD of the hGRα protein, suggesting that the hGR might also undergo S-palmitoylation.The aim of this thesis is to determine the role of the motif 663YLCMKTLLL671 in mediating rapid non-genomic glucocorticoid signaling following translocation and binding to the plasma membrane.The plasmids pRShGRαY663A, pRShGRαC665A and pRShGRαLL670/671AA were constructed by introducing the indicating mutations into the pRShGRα plasmid using PCR-assisted site-directed mutagenesis. Transactivation assays showed that compared with the wild-type receptor, the mutant receptors hGRαC665A and hGRαLL670/671AA demonstrated decreased ability to transactivate the glucocorticoid-inducible mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter at low concentrations of dexamethasone (< 10-6Μ), but similar ability to transactivate the MMTV promoter at higher dexamethasone concentrations (10-6Μ, 10-5Μ); the mutant receptor hGRαY663A displayed decreased transactivational activity at all dexamethasone concentrations. Nuclear translocation assays showed that the mutant receptor hGRαC665A required 36 minutes to translocate from the cytoplasm to the nucleus, suggesting a 2,6-fold delay compared to the time required for hGRαWT nuclear translocation.To study the membrane localization of the hGRα, we performed immunofluorescence experiments. We showed that both the hGRαWT and the mutant receptors hGRαY663A, hGRαC665A and hGRαLL670/671AA showed similar distribution to the plasma membrane. These results were confirmed by subcellular fractionation experiments. Addition of 2-bromopalmitate did not prevent membrane localization of the receptor or colocalization with caveolin-1.In kinase signaling assays, we demonstrated that neither the mutant receptors nor the addition of 2-bromopalmitate did prevent the diphasic activation of MAPK signaling pathway in the early time points. Moreover, there was no essential difference in the activation of PI3K pathway, both in the absence or presence of the 2-bromopalmitate.Finally, we performed palmitoylation assays using 9,10-3H(N) palmitic acid in order to determine whether the hGRα is a palmitoylated protein. We demonstrated that the hGRα does not undergo palmitoylation.In conclusion, the motif 663YLCMKTLLL671 does not play a role in the membrane localization of hGRα and it is not involved in mediating rapid non-genomic glucocorticoid effects. Moreover, the hGRα is not a palmitoylated protein.

Τα γλυκοκορτικοειδή αποτελούν μέλη της οικογένειας των στεροειδών ορμονών τα οποία ασκούν τις δράσεις τους μέσω του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών (hGR, human glucocorticoid receptor), ο οποίος δρα ως μεταγραφικός παράγοντας επηρεάζοντας την έκφραση γονιδίων-στόχων. Εκτός από τις γενωμικές δράσεις, τα γλυκοκορτικοειδή ασκούν ορισμένες ταχείες μη γενωμικές δράσεις, οι οποίες φαίνεται να διαμεσολαβούνται από μεμβρανικούς υποδοχείς. Η S-παλμιτυλίωση αποτελεί μια μετα-μεταφραστική τροποποίηση κατά την οποία καταλύεται η προσθήκη παλμιτικού οξέος σε κυστεΐνες. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι οι υποδοχείς των στεροειδών ορμονών, πλην του υποδοχέα των αλατοκορτικοειδών, υφίστανται παλμιτυλίωση σε ένα μοτίβο 9 αμινοξέων στην περιοχή σύνδεσης με τον προσδέτη. Μια παρόμοια ομόλογη αλληλουχία είναι παρούσα στην ίδια περιοχή στον hGRα (663YLCMKTLLL671), οδηγώντας στην υπόθεση ότι ο hGRα ενδέχεται να παλμιτυλιώνεται. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση του ρόλου του μοτίβου 663YLCMKTLLL671 στη μεμβρανική εντόπιση του hGRα, στο συνεντοπισμό με την καβεολίνη-1 και στις ταχείες μη γενωμικές δράσεις των γλυκοκορτικοειδών μέσω ενεργοποίησης των MAPK και της PI3K. Επίσης, θα απαντηθεί το ερώτημα εάν ο hGRα παλμιτυλιώνεται. Η σύνθεση των μεταλλαγμένων υποδοχέων hGRαΥ663Α, hGRαC665A και hGRαLL670/671AA πραγματοποιήθηκε με σημειακή κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση. Ακολούθησε αλληλούχηση για την επιβεβαίωση των μεταλλάξεων. Στις δοκιμασίες ενεργοποίησης δείξαμε ότι συγκριτικά με τον hGRαWT, οι υποδοχείς hGRαC665A και hGRαLL670/671AA παρουσιάζουν ελαττωμένη ικανότητα ενεργοποίησης του υποκινητή του ΜΜΤV σε χαμηλές συγκεντρώσεις δεξαμεθαζόνης και την ίδια ικανότητα ενεργοποίησης του υποκινητή αυτού σε υψηλότερες συγκεντρώσεις δεξαμεθαζόνης. Ο υποδοχέας hGRαY663A παρουσίασε ελάττωση της ικανότητας ενεργοποίησης του υποκινητή ΜΜΤV σε όλες τις συγκεντρώσεις δεξαμεθαζόνης. Σε δοκιμασίες μετατόπισης του hGRα στον πυρήνα, δείξαμε ότι ο hGRαC665A εμφανίζει καθυστέρηση μετατόπισης κατά 2,6 φορές, σε σχέση με τον hGRαWT. Σε πειράματα ανοσοφθορισμού δείξαμε ότι τόσο ο hGRαWT όσο και οι μεταλλαγμένοι υποδοχείς εντοπίζονται κυρίως στο κυτταρόπλασμα και στην κυτταρική μεμβράνη. Τα αποτελέσματα του ανοσοφθορισμού επιβεβαιώθηκαν με υποκυτταρική κλασμάτωση και στύπωμα κατά Western. Σε πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού δείξαμε ότι ο hGRαWT και οι μεταλλαγμένοι υποδοχείς συνεντοπίζονται με την καβεολίνη-1 στην κυτταρική μεμβράνη. Η προσθήκη του αναστολέα της παλμιτυλίωσης 2-βρωμοπαλμιτικού (2-Βr) δεν απέτρεψε τον εντοπισμό στην κυτταρική μεμβράνη και τον συνεντοπισμό με την καβεολίνη-1 τόσο του hGRαWT όσο και των μεταλλαγμένων υποδοχέων.Στις δοκιμασίες ενεργοποίησης των MAPK και της PI3K δείξαμε ότι τόσο ο hGRαWT όσο και οι μεταλλαγμένοι υποδοχείς επάγουν διφασικά την ενεργοποίηση των MAPK σε χρόνο 5 και 15 λεπτών. Η προσθήκη του αναστολέα 2-Βr δεν απέτρεψε την ενεργοποίηση του μονοπατιού αυτού. Το σηματοδοτικό μονοπάτι της PI3K δεν φαίνεται να επηρεάζεται από τον hGRαWT ή τους μεταλλαγμένους υποδοχείς στην παρουσία ή απουσία του αναστολέα 2-Βr.Τέλος, στις μελέτες παλμιτυλίωσης δείξαμε ότι η καβεολίνη-1 υφίσταται παλμιτυλίωση, ενώ οι τιμές cpm για τον hGRαWT εμπίπτουν στις αντίστοιχες τιμές του αρνητικού προτύπου, αποτέλεσμα το οποίο δείχνει ότι ο hGRα δεν υφίσταται παλμιτυλίωση.