Γενετική ανάλυση σε οικογένειες με ιστορικό καρκίνου μαστού και ωοθηκών με χρήση κλασσικής και επόμενης γενεάς (genomic capture) ανάλυσης του γενετικού υλικού

Abstract

Breast cancer is the most common form of cancer and the leading cause of cancer-related deaths among women, both in developed and developing countries, while ovarian cancer is the eighth most common form of cancer worldwide. A percentage of 5-10% of these malignancies is explained by the presence of high, medium or low penetrance pathogenic mutations in tumor suppressor genes. Identifying such mutations in patients diagnosed with breast or ovarian cancer contributes significantly in optimizing the effectiveness of their clinical management, as well as in reducing the possibility of a new malignancy being developed in themselves or in members of their family. Beyond its clinical value, genetic analysis of hereditary breast/ovarian cancer also contributes to more efficient diagnosis and treatment through the ever-increasing understanding of the molecular mechanisms of disease progression.φThe aim of the doctoral research project presented here is the identification of mutations not only in the well-studied, highly penetrant BRCA1/2 genes, but also in a variety of other genes, which have not been analyzed to a similar depth yet. Our study cohort was comprised of a relatively large number of women diagnosed with breast or ovarian cancer, unselected for family history. The analysis initially focused on the sequencing of BRCA1 and BRCA2 genes by the Sanger method. Pathogenic mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes were detected in 8,11% of patients. Two of these mutations are novel genetic changes that have not been recorded previously. Additionally, five missense variants of unknown clinical significance were detected. We used a variety of bioinformatic tools in order to assess their pathogenicity.RAD51C gene is another breast/ovarian cancer susceptibility gene, of medium penetrance. In the present study, a number of women diagnosed with breast or ovarian cancer were tested for a specific RAD51C mutation, (c.706-2A> G). The screening started by Real Time PCR and continued with the Next-Generation sequencing method. The aforementioned mutation was identified in thirteen female patients. Some of them also presented a family history of breast or ovarian cancer. Haplotype analysis showed that this genetic finding (c.706-2A> G) is a founder mutation for the Greek population. The gene RAD51D was also studied in the present study. The protein encoded is a member of the RAD51 protein family that plays an important role in DNA repair mechanisms. We have identified four pathogenic genetic findings and several missense variants of unknown clinical significance, subsequently studied extensively in order to evaluate their pathogenicity.Finally, DNA from 35 women were analyzed with the Trusight Cancer Gene Panel as part of the study presented in this thesis. All patients who participated in this particular cohort were diagnosed with Triple Negative Breast Cancer at the age of 35 years. 20% of these patients were found to carry pathogenic mutations in one of the BRCA1, BRCA2, ERCC3 and MUTYH genes. Additionally, missense and intronic variants of unknown clinical significance were identified in high and medium penetrance genes such as BRCA2, RAD51C, BRIP1, SLX4, RECQL4 and PALB2.Since the majority of mutant genes are involved in the homologous recombination process, these patients may benefit from new generation drugs that target homologous recombination such as PARP inhibitors.

Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί τον πιο συχνά εμφανιζόμενο καρκίνο και την κυριότερη αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες, τόσο στις αναπτυγμένες όσο και τις αναπτυσσόμενες χώρες, ενώ ο καρκίνος των ωοθηκών αποτελεί τον 8ο πιο συχνό καρκίνο παγκοσμίως. Σήμερα γνωρίζουμε πως ένα ποσοστό 5-10% των καρκίνων του μαστού σχετίζεται με την ύπαρξη μεταλλάξεων υψηλής, μεσαίας ή χαμηλής διεισδυτικότητας σε ογκοκατασταλτικά κυρίως γονίδια. Η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός παθογόνου μετάλλαξης σε μία ασθενή συμβάλει στη βέλτιστη κλινική της διαχείριση αλλά και στη δυνατότητα πρόληψης της εμφάνισης μίας νέας κακοήθειας στην ίδια ή σε κάποιο μέλος της οικογένειάς της. Σε ερευνητικό επίπεδο η γενετική ανάλυση στον κληρονομικό καρκίνο του μαστού-ωοθηκών συμβάλει στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών της δημιουργίας και της εξέλιξης της νόσου αλλά και στη βέλτιστη φαρμακευτική αντιμετώπισή της. Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε σκοπό την ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισμό μεταλλάξεων όχι μόνο στα γνωστά και υψηλής διεισδυτικότητας γονίδια BRCA1,2 αλλά και σε άλλα γονίδια, λιγότερο γνωστά έως σήμερα. Την ομάδα μελέτης μας αποτέλεσε μεγάλος αριθμός γυναικών με καρκίνο μαστού ή ωοθηκών, με ή χωρίς οικογενειακό ιστορικό. Η ανάλυση ξεκίνησε με τον έλεγχο των γονιδίων BRCA1 και BRCA2 τα οποία λειτουργούν ως σημείο αναφοράς και την κλασσική μέθοδο κατά Sanger. Ανιχνεύθηκαν οκτώ παθογόνοι γενετικές αλλαγές, σε εννέα από τις 111 ασθενείς που αναλύθηκαν για τα γονίδια BRCA1 και BRCA2 (ποσοστό 8,11%) . Μάλιστα οι δύο από το σύνολο των 8 μεταλλάξεων που ανευρέθηκαν στα γονίδια BRCA1,2 αποτελούν καινοφανείς γενετικές αλλαγές, δηλαδή αλλαγές που δεν έχουν καταγραφεί ποτέ στην παγκόσμια βιβλιογραφία. Ανιχνεύθηκαν επιπλέον πέντε παρανοηματικές παραλλαγές αγνώστου κλινικής σημασίας στο σύνολο των ασθενών, για τις οποίες χρησιμοποιήθηκαν διάφορα εργαλεία βιοπληροφορικής με στόχο την αξιολόγηση της παθογένειάς τους.Συνέχεια της μελέτης μας αποτέλεσε η ανάλυση μεγάλου αριθμού γυναικών που είχαν διαγνωσθεί με καρκίνο μαστού ή ωοθηκών για την ανίχνευση της μετάλλαξης (c.706-2A>G) , στο γονίδιο RAD51C. Ο έλεγχος ξεκίνησε με συμβατικές μεθόδους αλληλούχησης (Real Time PCR) και συνεχίστηκε με επόμενης γενεάς αλληλούχηση του γενετικού υλικού. Η εν λόγω μετάλλαξη ταυτοποιήθηκε σε δεκατρείς γυναίκες ασθενείς, που είχαν διαγνωσθεί με καρκίνο μαστού ή ωοθηκών και είχαν ή όχι οικογενειακό ιστορικό. Ακολούθησε η στοχευμένη ανάλυση μεγάλου αριθμού υγιών μετεμμηνοπαυσιακών γυναικών, σε καμία από τις οποίες δεν ανιχνεύθηκε η συγκεκριμένη γενετική αλλαγή, ενώ η ανάλυση απλοτύπων που ακολούθησε απέδειξε πως η εν λόγω αλλαγή αποτελεί ιδρυτική μετάλλαξη για τον ελληνικό πληθυσμό.Παράλληλα, μελετήθηκε εκτενώς το γονίδιο RAD51D στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής, το οποίο ανήκει στην ίδια οικογένεια πρωτεϊνών με το γονίδιο RAD51C. Χρησιμοποιώντας κλασσικές αλλά και νέες μεθόδους αλληλούχησης του γενετικού υλικού, ταυτοποιήσαμε τέσσερις παθογόνους γενετικές αλλαγές αλλά και αρκετά ευρήματα αγνώστου κλινικής σημασίας τα οποία μελετήσαμε στη συνέχεια εκτενώς με σκοπό την αξιολόγηση της παθογένειάς τους. Τέλος, κατά τη διάρκεια της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής αναλύθηκε το γενετικό υλικό 35 γυναικών με το πολυγονιδιακό πάνελ Trusight Cancer Gene Panel. Όλες οι ασθενείς που έλαβαν μέρος στη μελέτη είχαν διαγνωσθεί με Τριπλά Αρνητικό Καρκίνο του Μαστού σε ηλικία μικρότερη των 35 χρόνων. Το 20% των ασθενών αυτών βρέθηκε να φέρει παθογόνο γενετική αλλαγή σε κάποιο από τα γονίδια BRCA1, BRCA2, ERCC3 και MUTYH. Επιπλέον ταυτοποιήθηκαν ευρήματα αγνώστου κλινικής σημασίας σε γονίδια υψηλής και μεσαίας διεισδυτικότητας όπως τα BRCA2, RAD51C, BRIP1, SLX4, RECQL4 και PALB2.Δεδομένου ότι η πλειονότητα των γονιδίων που φέρουν παθογόνους μεταλλάξεις συμμετέχουν στη διαδικασία του ομόλογου ανασυνδυασμού ενδέχεται οι ασθενείς αυτές να επωφεληθούν από τα φάρμακα νέας γενιάς που στοχεύουν στον ομόλογο ανασυνδυασμό όπως οι αναστολείς της πολυμεράσης PARP.