Η βελτιστοποίηση της διαγνωστικής απόδοσης της αλληλούχισης επόμενης γενιάς του DNA (Next Generation Sequencing/NGS) στην ιατρική γενετική, μέσω βιοπληροφορικών και εργαστηριακών διαδικασιών

Abstract

7.000–8.000 different rare diseases (RDs) have been recognized to date, and in approximately 80% an underlying genetic cause is recognized. WES has proven to be significantly valuable in the characterization of underlying genetic defects in most RDs, reaching diagnostic yields between 30–50%; higher than any other molecular genetic method so far. Nonetheless, in about half of RD patients, a definitive molecular diagnosis may not be reached, due to inherent difficulties in identification of causative structural variants and limited experience with valid classification of single nucleotide variants (SNVs). Recent technological and bioinformatics advances have contributed to the development of efficient bioinformatics tools capable of identifying copy number variants (CNVs) and short tandem repeats (STRs) from WES data, which were initially thought to escape detection. To further improve the diagnostic yield of WES, amongst 1560 patients referred for WES to our lab, 820 unresolved cases were reanalysed, including further implementation of new and recently developed bioinformatics tools that allow the detection of CNVs and STRs from WES raw data. For CNV calling the ExomeDepth algorithm was selected, while STR detection was performed using the ExpansionHunter tool. Specifically, amongst the 820 cases, reanalysis of SNVs combined with detection of CNVs was performed in 36, reanalysis of SNVs in 84, and detection of CNVs in 700, of which in 10 STR detection was also applied. Reassessment of WES findings allowed characterization of a causative variant in 74 (in 60 CNVs and 14 SNVs), resolving 9% of cases which increased the overall diagnostic yield of WES by 4.8% {from 47.4% (740/1560) to 52.2% (814/1560)}. In addition, application of ExpansionHunter was successful in determining the exact number of repeats and STRs expansions in all 10 WES cases analyzed. Therefore, reanalysis of existing WES data increases the diagnostic yield in light of improved bioinformatics pipeline and updated literature. WES enables ancillary detection of different types of causative genetic variants by a single method, allowing characterization of diagnostic genotypes whilst concurrently minimizing the test cost to the patient/family and the time to a definitive diagnosis, and thus it should be the critical first-tier diagnostic test for patients with RDs.

Ο συνολικός αριθμός των σπανίων παθήσεων εκτιμάται ότι είναι 7.000-8.000, και περίπου στο 80% εξ’ αυτών έχει αναγνωριστεί η υποκείμενη γενετική αιτιολογία. Σήμερα, ισχυρό εργαλείο για τον προσδιορισμό της μοριακής αιτιολογίας των σπανίων παθήσεων αποτελεί η τεχνολογία αλληλούχησης των εξονίων του γονιδιώματος (WES), καθώς η διαγνωστική της απόδοση κυμαίνεται στο 30-50%, υψηλότερη συγκριτικά με τις συμβατικές μεθοδολογίες. Ωστόσο, παρά την εφαρμογή της, περισσότεροι από τους μισούς ασθενείς με σπάνιο γενετικό νόσημα παραμένουν αδιάγνωστοι, κυρίως λόγω των αδυναμιών στην ανίχνευση διαφορετικών κατηγοριών αιτιοπαθογόνων παραλλαγών και της περιορισμένης εμπειρίας στην έγκυρη ταξινόμηση των σημειακών παραλλαγών (SNVs). Οι πρόσφατες τεχνολογικές και βιοπληροφορικές εξελίξεις έχουν συμβάλει στην ανάπτυξη αποτελεσματικών βιοπληροφορικών εργαλείων, ικανών να ανιχνεύουν παραλλαγές αριθμού αντιγράφων (CNVs) και μικρές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (STRs) από δεδομένα WES, οι οποίες δεν μπορούσαν να εντοπιστούν πρωτύτερα και θεωρούνταν ότι διέφευγαν της ανίχνευσης. Στην παρούσα διατριβή, με στόχο την περαιτέρω βελτίωση της διαγνωστικής απόδοσης του WES, από τους 1560 συνολικά εξετασμένους ασθενείς του Εργαστηρίου Ιατρικής Γενετικής στους 820 που παρέμεναν χωρίς διάγνωση πραγματοποιήθηκε επανεξέταση των βιοπληροφορικών δεδομένων, χρησιμοποιώντας και αξιολογώντας παράλληλα νέα και πρόσφατα ανεπτυγμένα βιοπληροφορικά εργαλεία που επιτρέπουν την ανίχνευση CNVs και STRs από δεδομένα WES. Για τον εντοπισμό των CNVs χρησιμοποιήθηκε το εργαλείο ExomeDepth, ενώ για τα STRs το ExpansionHunter. Συγκεκριμένα, από τα 820 περιστατικά υλοποιήθηκε: α) επανεξέταση των SNVs σε συνδυασμό με ανίχνευση των CNVs σε 36, β) επανανάλυση αποκλειστικά των SNVs σε 84 και γ) ανίχνευση μόνο των CNVs σε 700, εκ των οποίων 10 χρησιμοποιήθηκαν πιλοτικά και για την εκτίμηση του μεγέθους των επεκτάσεων STRs. Από την εκ νέου ανάλυση των 820 αδιάγνωστων περιστατικών αιτιοπαθογόνο εύρημα ταυτοποιήθηκε στα 74 (στα 60 CNV και στα 14 SNV), με αποτέλεσμα να αποσαφηνιστεί η υποκείμενη γενετική αιτία στο 9% αυτών των περιστατικών και το ποσοστό της συνολικής διαγνωστικής απόδοσης του WES να αυξηθεί κατά 4,8%, φτάνοντας από το 47,4% (740/1560) στο 52,2% (814/1560). Επιπλέον, με το ExpansionHunter προσδιορίστηκε ο ακριβής αριθμός επαναλήψεων για κάθε αλληλόμορφο των ήδη ανευρεθεισών επεκτάσεων STRs και στα 10 περιστατικά WES που χρησιμοποιήθηκαν. Συνεπώς, η εκ νέου ανάλυση των υφιστάμενων δεδομένων αλληλούχησης WES προσφέρει τη δυνατότητα να αυξηθεί η διαγνωστική απόδοση υπό το πρίσμα της βελτιωμένης βιοπληροφορικής ροής και της επικαιροποιημένης βιβλιογραφίας. Συγχρόνως, το WES επιτρέπει τον εντοπισμό SNVs σε συνδυασμό με CNVs και STRs από μία μόνο μέθοδο, ελαχιστοποιώντας το κόστος και τον χρόνο για την τελική διάγνωση, λόγοι για τους οποίους θα πρέπει να αποτελεί τη σύγχρονη μέθοδο αναφοράς για τη διερεύνηση ασθενών με σπάνια γενετικά νοσήματα.