Αλληλούχηση επόμενης γενιάς (next generation sequencing) ως εργαστηριακό διαγνωστικό εργαλείο σε σπάνια γενετικά νοσήματα και αξιολόγηση των ευρημάτων με βιοπληροφορικές και εργαστηριακές μεθόδους

Abstract

About 6000 to 7000 different rare disorders with suspected genetic etiologies have been described and almost 4500 causative gene(s) have been identified. The advent of next-generation sequencing (NGS) technologies has revolutionized genomic research and diagnostics, representing a major advance in the identification of pathogenic genetic variations. This thesis presents the application of NGS as laboratory diagnostic tool in rare genetic disorders, where 500 patients were referred for genetic analysis of disorders with unknown, but likely genetic, etiology. A phenotype-driven proband-only exome sequencing (ES) strategy was applied for the investigation of rare disorders, in the context of optimizing ES diagnostic yield and minimizing costs and time to definitive diagnosis. Overall molecular diagnostic yield reached 50% in the proband cohort and characterized 279 pathogenic variants in 248 cases, 125 of which were novel and 154 known contributing information to the international community of disease and variant databases. Additionally, in this study a consanguineous family from Afghanistan is presented, with a novel homozygous synonymous pathogenic variant c.783G>A, p. (Ala261Ala) in the ARPC1B gene that causes a similar syndrome but no thrombocytopenia. Recently, a novel syndrome of combined immune deficiency, infections, allergy, and inflammation has been attributed to mutations in the gene encoding actin-related protein 2/3 complex subunit 1B (ARPC1B), which is a key molecule driving the dynamics of the cytoskeleton. Homozygous mutations in the ARPC1B gene have been found to result in the disruption of the protein structure and cause an autosomal recessive syndrome of combined immune deficiency, impaired T-cell migration and proliferation, increased levels of immunoglobulin E (IgE) and immunoglobulin A (IgA), and thrombocytopenia. To date, only a few individuals have been diagnosed with the ARPC1B deficiency syndrome worldwide. Targeted RNA studies in members of the family in our study demonstrated that the variant affects the normal splicing process of mRNA, resulting in a marked reduction of the levels of primary (normal) RNA transcript of the ARPC1B gene in the affected patients and likely premature termination from the abnormally spliced mRNA. Overall, this study demonstrates that ES provides an opportunity to resolve the genetic etiology of many patients and disorders, supporting appropriate medical management and genetic counseling. In cases with complex phenotypes, the identification of complex genotypes may contribute to more comprehensive clinical management. In the context of effective multidisciplinary collaboration between clinicians and laboratories, ES provides an efficient and appropriate tool for first-tier genomic analysis.

Μέχρι σήμερα έχουν περιγραφεί περίπου 6000 με 7000 διαφορετικές σπάνιες ασθένειες με ύποπτη γενετική αιτιολογία και έχουν ταυτοποιηθεί σχεδόν 4500 σχετιζόμενα γονίδια. Η έλευση των τεχνολογιών προσδιορισμού αλληλουχίας επόμενης γενιάς (NGS) έχει φέρει επανάσταση στη γονιδιωματική έρευνα και διάγνωση, προσδίδοντας σημαντική πρόοδο στον εντοπισμό αιτιοπαθογόνων γενετικών παραλλαγών. Η παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζει την εφαρμογή του NGS ως εργαστηριακό διαγνωστικό εργαλείο σε σπάνιες γενετικές ασθένειες. Συμπεριλήφθηκαν 500 ασθενείς, οι οποίοι παραπέμφθηκαν για γενετική ανάλυση ασθενειών άγνωστης αιτιολογίας και εφαρμόστηκε μια βασισμένη στο φαινότυπο στρατηγική ανάλυσης, στα δεδομένα αλληλούχησης εξονίων. Στο πλαίσιο της βελτιστοποίησης της διαγνωστικής απόδοσης του ES και της ελαχιστοποίησης του κόστους και του χρόνου μέχρι την οριστική διάγνωση, εφαρμόσθηκε αλληλούχηση εξονίων μόνο του εξεταζόμενου ατόμου και εν συνεχεία στοχευμένος έλεγχος μελών οικογενείας για τη διερεύνηση πιθανών ευρημάτων. Η συνολική μοριακή διαγνωστική απόδοση έφτασε στο 50%, καθώς ανιχνεύθηκαν 279 παθολογικές παραλλαγές σε 248 θετικά περιστατικά. Από αυτές τις παραλλαγές 125 ήταν νέες και 154 γνωστές, συνεισφέροντας πολύτιμη πληροφορία στην επιστημονική κοινότητα με ανάρτησή τους σε βάσεις δεδομένων. Επιπλέον, σε αυτή τη μελέτη παρουσιάζεται μια οικογένεια με μια νέα ομόζυγη συνώνυμη παθογόνο παραλλαγή c.783G>A, p.(Ala261Ala) του γονιδίου ARPC1B που προκαλεί ένα νέο σύνδρομο συνδυασμένης ανοσοανεπάρκειας, λοιμώξεων, αλλεργιών και φλεγμονών. Το σύνδρομο αυτό έχει αποδοθεί σε παραλλαγές στο γονίδιο που κωδικοποιεί σύμπλοκη υπομονάδα 1B (ARPC1B), που σχετίζεται με την ακτίνη 2/3, η οποία είναι ένα βασικό μόριο που οδηγεί τη δυναμική του κυτταροσκελετού. Ομόζυγες παραλλαγές στο γονίδιο ARPC1B, έχει βρεθεί ότι διαταράσσουν τη δομής της πρωτεΐνης και προκαλούν το αυτοσωμικό υπολειπόμενο σύνδρομο συνδυασμένης ανοσοανεπάρκειας, εξασθενημένη μετανάστευση και πολλαπλασιασμό των Τ-κυττάρων, αυξημένα επίπεδα ανοσοσφαιρίνης Ε (IgE) και ανοσοσφαιρίνης Α (IgA ) και θρομβοπενία. Η στοχευμένη μελέτη RNA έδειξε ότι η παραλλαγή επηρεάζει τη διαδικασία ματίσματος του mRNA, με αποτέλεσμα μια αξιοσημείωτη μείωση των επιπέδων του πρωτογενούς (φυσιολογικού) μεταγράφου στους πάσχοντες ασθενείς και πρόωρο τερματισμό της πρωτεϊνοσύνθεσης. Το ES παρέχει την ευκαιρία να εντοπιστεί η γενετική αιτιολογία των νοσημάτων και να υποστηριχθεί η κατάλληλη ιατρική διαχείριση και γενετική συμβουλευτική, ενώ σε περιπτώσεις με σύνθετους φαινοτύπους, η ταυτοποίηση πολύπλοκων γονότυπων συμβάλει στην πιο ολοκληρωμένη κλινική διαχείριση. Στο πλαίσιο της αποτελεσματικής πολυεπιστημονικής συνεργασίας μεταξύ εργαστηριακών επιστημόνων και κλινικών ιατρών, το ES αποτελεί ένα αποτελεσματικό και κατάλληλο πρωτοβάθμιο εργαλείο για γονιδιωματική ανάλυση.