Απομόνωση και λειτουργικός χαρακτηρισμός in vitro και in vivo γονιδίων που κωδικοποιούν για συνθετάσες διτερπενίων

Abstract

The aim of this project was to study the biosynthetic pathway that leads to the biosynthesis of labdane-type diterpenes by identifying and functionally characterizing key genes. In total, four putative genes that could be involved in labdane-type biosynthetic pathway were identified and characterized. Chemical analysis of the terpene profile of resin from C. creticus subsp. creticus showed that diterpenes represent the majority of terpenes found naturally in resin, while monoterpenes and sesquiterpenes represented a smaller fraction. Gas chromatography–mass spectrometry (GC-MS) analysis of different plant tissues led to the identification for the first time of cis-abienol, neoabienol, larixol and two, yet unknown, similar to labda-7,13(E)-dien-15-ol-like products. Moreover, it was shown that the fruit of C. creticus subsp. creticus produces in larger quantities labdane diterpenes when compared to the fruit of C. creticus subsp. eriocephalus. Isolation and functional characterization revealed that CcLDDS1 and CcLDDS2 genes both express labda-7,13(E)-dien-15-ol diphosphate synthases (endo-7,13-CPS). Furthermore, characterization of the CcKS gene showed that it’s active in the biosynthetic pathway of gibberellins as it catalyzes the synthesis of ent-kaurene. Expression profile analysis of the identified genes showed that the CcKS gene exhibited a constitutive expression profile in all tissues suggesting a key role in the primary plant metabolism, while the rest of the genes were mostly active in young leaves. Leaves of the first two developmental stages are the most active tissue accumulating labdane-type diterpenes.

Η παρούσα διατριβή, είχε ως κύριο στόχο τη βαθύτερη κατανόηση, την απομόνωση και το λειτουργικό χαρακτηρισμό γονιδίων, που συμμετέχουν στο βιοσυνθετικό μονοπάτι λαβδανικών διτερπενίων στο φυτό C. creticus (λαδανιά). Από πειράματα, που πραγματοποιήθηκαν, βρέθηκαν, απομονώθηκαν και μελετήθηκαν τέσσερα πιθανά γονίδια. Επιπλέον συσχετίστηκε η έκφραση γονιδίων βιοσύνθεσης λαβδανικών διτερπενίων με την παραγωγή των αντίστοιχων ουσιών σε διάφορους ιστούς της λαδανιάς. Χημική ανάλυση της ρητίνης (C. creticus subsp. creticus) έδειξε ότι αποτελείται κυρίως από λαβδανικά διτερπένια και λιγότερο από μονοτερπένια ή σεσκιτερπένια. Από το σύνολο των χημικών αναλύσεων με αέριο χρωματογράφο (GC-MS) στον ιστό της λαδανιάς ταυτοποιήθηκαν για πρώτη φορά η cis-αβιενόλη, η νεοαβιενόλη, η λαριξόλη καθώς και δυο άγνωστες ουσίες λαβδανικής δομής ουσίες που ομοιάζουν με τη λαβδα-7,13(Ε)-διεν-15-όλη. Επίσης βρέθηκε ότι ο καρπός του υποείδους C. creticus subsp. creticus παράγει μεγαλύτερες ποσότητες λαβδανικών διτερπενίων, από ότι ο καρπός του υποείδους C. creticus subsp. eriocephalus. Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός των γονιδίων αυτών οδήγησε στην αναγνώριση της λειτουργίας τους. Συγκεκριμένα, βρέθηκε ότι τα γονίδια CcLDDS1 και CcLDDS2 κωδικοποιούν τις συνθετάσες της διφωσφορικής λαβδα-7,13(Ε)-διεν-15-όλης 1 και 2 (endo-7,13-CPS). Επιπλέον, χαρακτηρίστηκε το γονίδιο CcKS, που συμμετέχει στο μονοπάτι βιοσύνθεσης της γιββερελλίνης, καθώς παράγει ent-καουρένιο. Τέλος, χαρακτηρίστηκε η λειτουργία για το γονίδιο CcLAT, που κωδικοποιεί την ακετυλοτρανσφεράση μέσω της οποίας παράγονται οι οξικοί εστέρες των λαβδανικών διτερπενίων της λαβδα-7,13(E)-διεν-15-όλης καθώς και της λαβδα-13(Ε)-8α,15-διόλης. Η έκφραση των γονιδίων CcCLS, CcLDDS1, CcLDDS2, CcKS και CcLAT ελέγχθηκε σε ιστούς του φυτού C. creticus subsp. creticus, όπου και βρέθηκε να εμφανίζουν υψηλή έκφραση στα νεαρά φύλλα (1ου και 2ου αναπτυξιακού σταδίου). Από τα παραπάνω συμπεραίνουμε ότι τα νεαρά φύλλα συγκεντρώνουν την υψηλότερη έκφραση και παραγωγή των λαβδανικών διτερπενίων.