Συγκριτική επιδημιολογική μελέτη του ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη χρυσίζοντα σταφυλόκοκκου, στα γαλακτοπαραγωγικά ζώα, στο γάλα τους και τα γαλακτοκομικά προϊόντα, στο περιβάλλον και το προσωπικό εγκαταστάσεων επεξεργασίας γάλακτος της Βόρειας Ελλάδας

Abstract

Staphylococcus aureus is considered the third most common food-borne pathogen that causes food poisoning worldwide, while Methicillin-Resistant S. aureus (MRSA) represent a serious public-health concern due to their ability to colonize and infect both humans and animals. Recently, S. aureus and MRSA are increasingly isolated from lactating ruminants, milk and dairy products and it has been demonstrated that beside direct contact with infected animals, the handling and consumption of animal origin-food contaminated with S. aureus or MRSA could lead to the pathogens’ transmission to humans. Although MRSA surveillance data in Greek hospitals indicate that the prevalence of MRSA is one of the highest (38.8%) among European countries, little is known about the prevalence of LA-MRSA in the country. The aim of the present Doctoral Thesis was to investigate, for the first time in Greece, the epidemiology of MRSA along the production chain of dairy products, from the stable to ready-to-eat dairy products, in Northern Greece. A total of 1059 samples (farmers: 109, cows: 124, sheep: 215, goats: 123, raw milk: 96, food handlers: 87, dairy products: 93, equipment 212) from 6 dairy plants and the associated 64 dairy farms were collected from three geographical compartments (Epirus, East Macedonia and Thrace and Central Macedonia) of North Greece. All samples were examined for the presence of S. aureus according to ISO 6888-1 (ISO 1999). Up to 4 colonies from each positive sample were subjected to confirmation and molecular characterization, via the detection of the nuc and coa genes. The susceptibility of the isolated strains towards 14 antimicrobials was determined by the agar-dilution method according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) guidelines (CLSI 2009). All phenotypically confirmed MRSA strains were tested for the presence of mecA, mecC. Isolated MRSA strains were further characterized for the presence of selected virulence factors such as staphylococcal enterotoxins (sea, seb, sec, sed and see) and Panton-Valentine Leucocidin (PVL) genes and their ability to produce biofilms. Finally, the genetic variability of the MRSA isolates and the presence of epidemiological clones were assessed via pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and spa typing. Certain spa types (t065, t192, t337, t1773, t3536 t3586 and t13336) were isolated for the first time in Greece, while t127 was the most prevalent (14/38, 36,8%) and widely disseminated, indicating that it represents the predominant LA-MRSA type in Greece. Furthermore, spa type t034 (CC398) was isolated for the first time from livestock (goat) in Greece. PFGE typing of MRSA isolates revealed the presence of epidemiological clones in the dairy production chain, even within the dairy plants’ facilities, which likely act as sources of dairy product contamination. Our study’s findings suggest that the dairy production chain may contribute to the dissemination of MRSA, even enterotoxigenic strains, in the community and highlight the need for continuous monitoring of the dairy production chain, the need for re-evaluating the implemented cleaning and sanitizing processes and the adoption of preventive strategies in order to minimize public-health risks. Moreover, the isolation of MRSA from both human and animal sources, confirms the importance of the One Health approach in the prevention of staphylococcal infections and indicates the need for preventing strategies both in human and animal populations.

Ο χρυσίζων σταφυλόκοκκος (Staphylococcus aureus) αποτελεί σήμερα το τρίτο συχνότερο παθογόνο βακτήριο που προκαλεί τροφικές τοξινώσεις παγκοσμίως, ενώ ιδιαίτερα σοβαρό πρόβλημα για τη Δημόσια Υγεία αποτελούν τα ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη στελέχη (Μethicillin-Resistant S. aureus, MRSA), λόγω της ικανότητάς τους να αποικίζουν και να προσβάλλουν τόσο τους ανθρώπους όσο και τα ζώα. Τα τελευταία χρόνια, S. aureus και MRSA απομονώνονται όλο και συχνότερα από τα γαλακτοπαραγωγικά ζώα, το γάλα και τα γαλακτοκομικά προϊόντα και έχει διαπιστωθεί ότι, εκτός από την άμεση επαφή με τα ζώα, ο χειρισμός και η κατανάλωση τροφίμων ζωικής προέλευσης επιμολυσμένων με τέτοια στελέχη συμβάλλει επίσης στη μετάδοσή τους στους ανθρώπους. Στην Ελλάδα, παρά το γεγονός ότι τα επιδημιολογικά στοιχεία από τα νοσοκομεία της χώρας δείχνουν ότι το ποσοστό απομόνωσης στελεχών MRSA είναι από τα υψηλότερα (38.8%) στην Ευρώπη, πολύ λίγα στοιχεία είναι γνωστά για την παρουσία MRSA στελεχών στα παραγωγικά ζώα στην χώρα. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη, για πρώτη φορά στη χώρα μας, της επιδημιολογίας του ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη χρυσίζοντα σταφυλόκοκκου (MRSA) στην αλυσίδα παραγωγής γαλακτοκομικών προϊόντων, από το στάβλο έως τα τελικά προϊόντα, στην Βόρεια Ελλάδα. Για τον σκοπό αυτό λήφθηκαν συνολικά 1059 δείγματα (εκτροφείς: 109, αγελάδες: 124, πρόβατα: 215, αίγες: 123, νωπό γάλα: 96, χειριστές τροφίμων: 87, γαλακτοκομικά προϊόντα: 93 και εξοπλισμός: 212), από 6 εγκαταστάσεις επεξεργασίας γάλακτος και παραγωγής γαλακτοκομικών προϊόντων και 64 συνεργαζόμενες με αυτές εκτροφές γαλακτοπαραγωγικών ζώων, σε τρία γεωγραφικά διαμερίσματα (Ήπειρος, Ανατολική Μακεδονία και Θράκη και Κεντρική Μακεδονία) της Βορείου Ελλάδος. Τα δείγματα εξετάστηκαν για την παρουσία S.aureus σύμφωνα με τη μέθοδο ISO 6888-1 (ISO 1999). Έως τέσσερις αποικίες από κάθε θετικό δείγμα υποβλήθηκαν σε περαιτέρω μικροβιολογικές και μοριακές εξετάσεις για την ανίχνευση των γονιδίων nuc και coa. Στα στελέχη που απομονώθηκαν εξετάσθηκε η αντιμικροβιακή αντοχή έναντι 14 αντιμικροβιακών παραγόντων με τη μέθοδο διάχυσης σε άγαρ, σύμφωνα με το CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute 2009). Όλα τα φαινοτυπικώς ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη στελέχη (MRSA) εξετάστηκαν μοριακά (PCR) για την παρουσία των γονιδίων mecA και mecC. Τα απομονωθέντα στελέχη MRSA χαρακτηρίστηκαν με βάση την φορεία τους σε γονίδια παθογένειας όπως οι εντεροτοξίνες (sea, seb, sec, sed και see) και η λευκοκτονίνη Panton Valentine (PVL), και την ικανότητα τους να σχηματίζουν βιομεμβράνη. Τέλος, εξετάστηκε η γενετική ποικιλομορφία και καθορίστηκαν οι επιδημιολογικοί τύποι των MRSA στελεχών με την εφαρμογή της ηλεκτροφόρησης γέλης σε εναλλασσόμενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE) σε συνδυασμό με τη μέθοδο της τυποποίησης βάσει του γονιδίου της πρωτεΐνης Α (spa typing). Ορισμένοι spa τύποι (t065, t192, t337, t1773, t3536 t3586 και t13336) ανιχνευτήκαν για πρώτη φορά σε MRSA στελέχη στην Ελλάδα, ενώ ο τύπος που ανιχνεύτηκε συχνότερα (14/38, 36,8%) και παρουσίαζε την μεγαλύτερη γεωγραφική εξάπλωση ήταν ο t127, ο οποίος φαίνεται ότι αποτελεί τον κυρίαρχο τύπο μεταξύ των LA-MRSA στελεχών στην Ελλάδα. Επιπρόσθετα, διαπιστώθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα, η παρουσία του κλωνικού συμπλέγματος (CC) 398, spa τύπος t034 σε MRSA στέλεχος από ζώο (αίγα). Η μοριακή τυποποίηση των MRSA στελεχών με τη με την μέθοδο της PFGE αποκάλυψε την παρουσία επιδημιολογικών κλώνων στην αλυσίδα παραγωγής γαλακτοκομικών προϊόντων ακόμα και εντός των εγκαταστάσεων επεξεργασίας γάλακτος, οι οποίες ενδέχεται να δρουν ως πηγές επιμόλυνσης των τελικών προϊόντων. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αλυσίδα παραγωγής γαλακτοκομικών προϊόντων αποτελεί δυνητικό παράγοντα διάδοσης στελεχών MRSA, ακόμη και εντεροτοξινογόνων, στην κοινότητα και τονίζουν την ανάγκη για συνεχή παρακολούθησης της αλυσίδας παραγωγής γαλακτοκομικών προϊόντων, επανεκτίμηση των εφαρμοζόμενων διαδικασιών καθαρισμού και απολύμανσης και λήψη προληπτικών μέτρων, προκειμένου να περιοριστεί ο κίνδυνος για την δημόσια υγεία. Επιπλέον, η απομόνωση MRSA στελεχών τόσο από ανθρώπους όσο και από ζώα, επιβεβαιώνει το δόγμα της ενιαίας υγείας, καταδεικνύοντας την ανάγκη ενιαίας αντιμετώπισης του προβλήματος της αντιμικροβιακής αντοχής, με την λήψη μέτρων τόσο στον ανθρώπινο όσο και στο ζωικό πληθυσμό.