Μονοπάτια σηματοδότησης στα οποία συμμετέχει η νευροειδική πρωτεΐνη BM88/CEND1

Abstract

During development of the central nervous system (CNS), coordinated regulation of cell cycleprogression/exit and differentiation of neuronal precursors is essential for generation of appropriatenumber of neurons at the right time and place. A number of studies have shown that key regulators of cell cycle progression influence neural cell fate and differentiation and conversely, cell fate determinants and differentiation-inducing proteins regulate the cell cycle.BM88/Cend1 is a neuronal-lineage specific modulator participating in signaling pathways whichaffect the coordination of cell cycle exit and neuronal differentiation of neural stem/precursor cells.Cend1 displays a dynamic expression pattern during central nervous system development: it isexpressed at low levels in neurogenic progenitors residing at germinal layers and is upregulated asneuronal precursors exit the cell cycle and differentiate, while it persists at high levels in differentiated neurons. Accordingly, Cend1 ceases to be expressed in neural stem/progenitor cells when they switch from a neurogenic to a gliogenic fate. Gain- of-function approaches in neural stem/precursor cells generated from the embryonic brain and spinal cord or the postnatal subventricular zone, demonstrated that Cend1 negatively regulates proliferation, while promoting a neuronal fate. Conversely, Cend1 silencing using RNA interference or Cend1 ablation in Cend1-null mice resulted in the opposite phenotype. These findings suggest that Cend1 levels are important for controlling proliferation versus differentiation of neuronal precursors. The negative influence of Cend1 on cell proliferation is mediated through the cyclin D1/pRb signaling pathway that controls the balance between cell cycle progression and exit while its neuronal differentiation-promoting activity involves downregulation of Notch signaling and activation of proneural gene networks and downstream signaling pathways.However, the protein partners interacting directly with Cend1 were not known.Cend1 cloned from porcine, mouse, human and chick brain is an integral membrane proteincomposed of two 22-23 kDa polypeptide chains linked together by disulphide bridges. Cend1 is C-tail anchored to the outer membrane of intracellular organelles, such as mitochondria, the endoplasmic reticulum and other electrolucent vesicles, with the bulk of the protein facing the cytoplasm.In the present study we have identified Ran-binding protein M (RanBPM) as direct interactingpartner for Cend1 using a yeast-two hybrid system. RanBPM is a multi-domain intracellular proteinthat shuttles between the cytoplasm and the nucleus and has been shown to act as a scaffold for signal transduction for several receptors, nuclear proteins, transcription factors and cytoplasmic kinases in the immune and nervous systems. Interestingly, RanBPM has been implicated in cell cycle progression of neuronal precursors via an as yet unknown mechanism while it has been identified as a binding partner for the growth arrest protein Dyrk1B in lung epithelial cells. Dyrk1B belongs to the nuclear family of dual specificity tyrosine-phosphorylation regulated kinases which include several vertebrate, invertebrate and lower eukaryotic orthologs characterized by highly conserved Dyrk homology and kinase domains. Mammalian Dyrk1A and Dyrk1B and the Drosophila Minibrain kinases have been shown to affect proliferation and/or differentiation in a variety of cell types by regulating cyclin D1 levels. However, the expression and role of Dyrk1B in neuronal cells remain elusive.Here we investigated the possible cross-talk between Cend1, RanBPM and Dyrk1B in cell cycleprogression/exit of neuronal cells. First we showed that Cend1, RanBPM and Dyrk1B are expressed in mouse brain and in cultured embryonic cortical neurons while they can form complexes whenexpressed in HEK293T cells. Further, by co-expression experiments in transiently transfected mouseneuroblastoma Neuro 2a cells, we found that the Cend1-dependent or Dyrk1B-dependent downregulation of cyclin D1 is reversed following their interaction with RanBPM. More specifically,binding of RanBPM with either Cend1 or Dyrk1B stabilizes cyclin D1 in the nucleus and enhancescellular proliferation. In the case of Dyrk1B-RanBPM interaction this occurs because RanBPMfacilitates Dyrk1B proteasomal turnover. However, when all three proteins are co-expressed Dyrk1B is rescued in the nucleus to target cyclin D1 and exert its antiproliferative function. Additionally,coexpression of RanBPM with either BM88/Cend1 or Dyrk1B also had a negative effect on Neuro 2acell differentiation in the presence of retinoic acid as compared with cells expressing each proteinseparately. Our results show that the functional interactions between Cend1, RanBPM and Dyrk1Binfluences the balance between cellular proliferation and differentiation in Neuro 2a cells. This novelregulatory signaling pathway may also be operative in neuronal precursors to control the balancebetween cellular proliferation and neuronal differentiation.

Κατά την ανάπτυξη του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος, η συντονισμένη ρύθμιση της εξόδουαπό τον κυτταρικό κύκλο και της διαφοροποίησης των πρόδρομων νευρωνικών κυττάρων αποτελείπροϋπόθεση για την παραγωγή του απαιτούμενου αριθμού νευρώνων στο σωστό τόπο και χρόνο.Μελέτες έχουν δείξει ότι τα κύρια ρυθμιστικά μόρια που ελέγχουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου επηρεάζουν την κυτταρική μοίρα και τη νευρωνική διαφοροποίηση ενώ, αντίστροφα, μόρια που καθορίζουν την κυτταρική μοίρα και επάγουν τη διαφοροποίηση ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο.Η νευροειδική πρωτεΐνη BM88/Cend1 (cell cycle exit and neuronal differentiation1) συμμετέχει σεσηματοδοτικά μονοπάτια που συντονίζουν την έξοδο των προγονικών νευρικών κυττάρων από τονκυτταρικό κύκλο και επάγουν τη νευρωνική διαφοροποίηση. Ο μοριακός χαρακτηρισμός της Cend1,όπως πραγματοποιήθηκε μετά από κλωνοποίηση από τον εγκέφαλο χοίρου, ποντικού, ανθρώπου καικοτόπουλου, έδειξε ότι πρόκειται για διαμεμβρανική πρωτεΐνη, αποτελούμενη από δύο όμοιεςπολυπεπτιδικές αλυσίδες μεγέθους 22-23 kDa, που συγκρατούνται μεταξύ τους με δισουλφιδικόδεσμό. Μελέτες οπτικής και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας έδειξαν ότι η πρωτεΐνη Cend1 εντοπίζεταιστην εξωτερική μεμβράνη ενδοκυττάριων οργανιδίων, όπως τα μιτοχόνδρια, το ενδοπλασματικόδίκτυο και άλλα κυστίδια. Η Cend1 είναι αγκυροβολημένη στις μεμβράνες των οργανιδίων αυτώνμέσω του καρβοξυτελικού άκρου κατά τέτοιο τρόπο ώστε το αμινοτελικό της τμήμα που περιλαμβάνει το κύριο σώμα της πρωτεΐνης και διαμεσολαβεί τις πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, να βρίσκεται στραμμένο προς το κυτταρόπλασμα.Η Cend1 παρουσιάζει δυναμικό πρότυπο έκφρασης κατά την ανάπτυξη του Κεντρικού ΝευρικούΣυστήματος: εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα στα πρόδρομα νευρικά κύτταρα των βλαστικών στιβάδων του εγκεφάλου και αυξάνεται σε υψηλότερα επίπεδα καθώς τα πρόδρομα νευρικά κύτταρα οδηγούνται σε έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο ενώ διατηρείται σε υψηλά επίπεδα και στους διαφοροποιημένους νευρώνες. Από την άλλη πλευρά παύει να εκφράζεται στα προγονικά κύτταρα που πρόκειται να ακολουθήσουν γενεαλογία κυττάρων γλοίας.Λειτουργικές μελέτες υπερέκφρασης της Cend1 σε νευρικά βλαστικά κύτταρα εγκεφάλου ή νωτιαίου μυελού εμβρύου ποντικού και κοτόπουλου καθώς και σε βλαστικά κύτταρα τηςμεταγεννητικής υποκοιλιακής ζώνης του εγκεφάλου ποντικού, έδειξαν ότι έχει αρνητική επίδρασηστον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ενώ επάγει τη νευρωνική διαφοροποίηση. Αντίστροφα, η σίγαση της έκφρασης της Cend1 με τη χρήση μικρών παρεισφρητικών μορίων RNA (siRNAs) ή η γενετικήαπαλοιφή του γονιδίου σε ποντικούς (ΚΟ-Cend1), οδήγησαν στον αντίστροφο φαινότυπο. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν πως τα επίπεδα της Cend1 είναι σημαντικά για τον έλεγχο τουπολλαπλασιασμού έναντι της διαφοροποίησης των πρόδρομων νευρικών κυττάρων. Σύμφωνα με τιςμελέτες αυτές αποκαλύφθηκε ότι η αρνητική επίδραση της Cend1 στον κυτταρικό πολλαπλασιασμόλαμβάνει χώρα μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού της κυκλίνης D1 και της πρωτεΐνης τουρετινοβλαστώματος (cyclin D1/pRb) που ρυθμίζουν την ισορροπία μεταξύ κυτταρικού κύκλου καιδιαφοροποίησης ενώ η ικανότητά της να επάγει τη νευρωνική διαφοροποίηση σχετίζεται με τηνκαταστολή του σηματοδοτικού μονοπατιού Notch και την ενεργοποίηση προνευρικών γονιδίων. Παρά την κατ’ αρχήν διαλεύκανση του μηχανισμού δράσης της, οι πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν άμεσα με τη Cend1 παρέμεναν άγνωστες.Στην παρούσα μελέτη προσδιορίστηκε η πρωτεΐνη Ran-binding protein M (RanBPM) ως μόριο πουαλληλεπιδρά άμεσα με τη Cend1. Η πρωτεΐνική αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο μορίωνπροσδιορίστηκε με την εφαρμογή συστήματος ζύμης δύο υβριδίων και στη συνέχεια επιβεβαιώθηκεμε βιοχημικές μεθόδους. Η RanBPM χαρακτηρίζεται ως «μόριο-ικρίωμα» με κομβικό ρόλο τόσο στονευρικό όσο και το ανοσοποιητικό σύστημα όπου συμμετέχει σε πληθώρα σηματοδοτικώνμονοπατιών. Αλληλεπιδρά με πολλές και διαφορετικές πρωτεΐνες, όπως μεταγραφικοί παράγοντες,άλλες πυρηνικές πρωτεΐνες, κυτταροπλασματικές κινάσες, υποδοχείς της πλασματικής μεμβράνηςκ.α. Έτσι συμμετέχει σε διάφορα μονοπάτια μεταγωγής σήματος από τον εξωκυττάριο χώρο προς το κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα και αντίστροφα. Μεταξύ αυτών, υπάρχουν ενδείξεις για συμμετοχή της στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου των πρόδρομων νευρικών κυττάρων μέσω άγνωστου μέχρι στιγμής μηχανισμού ενώ σε επιθηλιακά κύτταρα πνεύμονα έχει ταυτοποιηθεί ως πρωτεϊνικός συνεργάτης της η διπλής εξειδίκευσης κινάση σερίνης/θρεονίνης Mirk/Dyrk1B. Η Dyrk1B ανήκει στην ευρύτερη οικογένεια των Dyrk κινασών (dual specificity tyrosine-phosphorylation regulated kinases) που περιλαμβάνει ορθόλογα μέλη στα σπονδυλωτά, τα ασπόνδυλα και τους κατώτερους ευκαρυώτες, χαρακτηριζόμενα από ισχυρά συντηρημένη ομολογία των αλληλουχιών τους, ιδίως των τμημάτων που σχετίζονται με τη λειτουργία της κινάσης. Οι κινάσες των θηλαστικών Dyrk1A και Dyrk1B, καθώς και εκείνη της μύγας Drosophila, έχει δειχθεί ότι επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό και/ή τη διαφοροποίηση σε μία ποικιλία κυτταρικών τύπων, ρυθμίζοντας τα επίπεδα της κυκλίνης D1.Εντούτοις, η έκφραση και ο ρόλος της Dyrk1B στο νευρικό σύστημα παραμένει αδιευκρίνιστος.Στα πλαίσια διατριβής, μελετήθηκε η συνδυασμένη δράση των τριών πρωτεϊνών Cend1, RanBPMκαι Dyrk1B στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου των νευρικών κυττάρων. Αρχικά δείχθηκε πως καιοι τρεις πρωτεΐνες εκφράζονται στον εγκέφαλο του ποντικού καθώς και σε πρωτογενείς καλλιέργειες φλοιικών νευρώνων εμβρύου ποντικού, ενώ δύνανται να σχηματίζουν σύμπλοκα όταν εκφράζονταιεξωγενώς σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Στη συνέχεια, με πειράματα συνέκφρασης σε παροδικά μετασχηματισμένα κύτταρα νευροβλαστώματος ποντικού Neuro-2a, διαπιστώθηκε πως η επαγόμενηαπό την Cend1 ή την Dyrk1B μείωση των πρωτεϊνικών επιπέδων της κυκλίνης D1, αναστρέφεταιπαρουσία της RanBPM. Ειδικότερα, η αλληλεπίδραση της RanBPM είτε με την Cend1 είτε με τηνDyrk1B, σταθεροποιεί την κυκλίνη D1 στον πυρήνα, ευνοώντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.Στην περίπτωση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των Dyrk1B και RanBPM, αυτό συμβαίνει γιατί ηRanBPM διευκολύνει την αποικοδόμηση της κινάσης Dyrk1B από το 26S πρωτεάσωμα. Όταν πάλικαι οι τρεις πρωτεΐνες συνεκφράζονται στα κύτταρα Neuro-2a, η Dyrk1B διασώζεται στον πυρήναόπου φωσφορυλιώνει την κυκλίνη D1 και καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό. Επιπρόσθετα, ηαλληλεπίδραση της RanBPM είτε με την Cend1 είτε με την Dyrk1B, φάνηκε να επηρεάζει αρνητικάτη διαφοροποίηση των κυττάρων Neuro-2a παρουσία ρετινοϊκού οξέος, σε σύγκριση με κύτταραμετασχηματισμένα με καθεμία από τις τρεις πρωτεΐνες ξεχωριστά. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της μελέτης υποδεικνύουν πως η αλληλεπίδραση των τριών πρωτεϊνών επηρεάζει την ισορροπία μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης σε κύτταρα Neuro-2a. Η μελέτη μας ανέδειξε ένα νέο ρυθμιστκό σηματοδοτικό μονοπάτι που είναι πιθανόν να ελέγχει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη νευρωνική διαφοροποίηση στα πρόδρομα νευρικά κύτταρα.