Μελέτη και κλινική αξιολόγηση των κυκλοφορούντων microRNAs ως νέων βιοδεικτών καρκίνου

Abstract

Circulating miRNAs have intensively attracted a lot of interest as promising blood based biomarkersfor diagnosis, prognosis and therapy monitoring of cancer patients.This growing interest for the determination of circulating miRNAs concentration levels in plasmarequires robust methodologies for their quantification, such as RT-qPCR, as well as carefulconsideration of the effects of pre-analytical and analytical parameters on the isolation, stability andquantification of circulating miRNAs.In the present study, the effect of four different miRNA isolation systems and different storageconditions of plasma samples were evaluated respecting to quantitation of circulating miRNAs usingRT-qPCR. The evaluation was based on the recovery of an exogenous control that was added inknown amount in all samples and relative recoveries of endogenous miRNAs. Besides, the stabilityof extracted miRNAs during long term storage as well as the effect of data normalization procedureon the quantification of circulating miRNAs in plasma were studied.Silica-column based RNA extraction methods are more effective and reliable in respect to TRIzol LS.Circulating miRNAs are more stable when plasma samples are kept at -70˚C. After extraction,miRNAs remain stable for up to one year at -70oC. When normalization is based on a combination of an endogenous and an exogenous control miRNA, differences in miRNAs recovery and differencesin cDNA synthesis between samples are compensated.Subsequently, we proceeded to the study and clinical evaluation of circulating miRNAs in plasmasamples and corresponding primary tissues of two cancer types: non-small cell lung cancer (NSCLC)and breast cancer which are very frequent both in Greece and all over the world according tobibliography reports.Thus, we measured the expression levels of miR-21, miR-126*, miR-451, miR-30d, miR-10a and miR 30e-5p in primary tumors and corresponding plasma samples of NSCLC patients. In a next step, the results from primary tumors and plasma samples were compared to be ascertained whether the expression levels of miRNAs in primary tissues are reflected by the concentration levels of circulating miRNAs in plasma. In addition to, we studied the correlation between the expression levels of miRNAs in tissues or concentrationlevels of circulating miRNAs in plasma and the clinicopathological characteristics of patients for both types of cancer. At last, we evaluated their prognostic significance performing Kaplan-Meier survival analysis for DFI and OS.The expression levels of miR-451, miR-126* and miR-30d are reduced in primary cancerous tissues in comparison to adjacent non-cancerous tissues, while those of miR-21 are increased. Besides, in the present study, the expression levels of miR-10a and miR-30e-5p were studied for the first time in bibliography and the results indicated that miR-30e-5p expression levels are reduced in primary cancerous tissues in comparison to adjacent non-cancerous tissues, while miR-10a expression levels are not differentiated. The increased levelsof miR-21 in primary tumors of NSCLC patients are associated with shorter DFI and OS.Concerning the concentration levels of circulating miRNAs in corresponding plasma samples of the same NSCLC patients, circulating miR-21 concentration levels are elevated in plasma samples of these patients in comparison to healthy plasma samples and are associated with shorter DFI and OS, while miR-10a concentration levels are reduced and are associated with short DFI. Lastly, the concentration levels of miR30e-5p are increased in plasma samples of NSCLC patients and are correlated with short OS.In respect to breast cancer patients, we measured the expression levels of miR-21, miR-146a, miR-210, miR31 and miR-200c in primary tumors and corresponding plasma samples of the same patients. Subsequently, these results were correlated: a) between the two different biologic samples; b) with the clinicopathological characteristics of patients; c) with progression free survival (PFS) and overall survival (OS) of patients and d) with the presence of circulating tumor cells in peripheral blood of breast cancer patient.The expression levels of miR-21, miR-146a, miR-210 and miR-200c are increased, while those of miR-31 are reduced, in primary tumor tissues of breast cancer patients in comparison to healthy tissues and it is interesting the fact that the expression levels of miR-21, miR-146a and miR-210 are higher in operable patients than metastatic patients while those of miR-31 are lower in metastatic patients than operable patients. The increasedexpression levels of miR-21 and miR-146a are correlated with ER and PR absence in primary tumor tissues, while the reduced expression levels of miR-31 are associated with advanced stage.The concentration levels of miR-21, miR-146a and miR-210 are higher in plasma samples of breast cancer patients than healthy donors, while those of miR-31 and miR-200c are not detectable. The increased concentration levels of miR-210 in plasma samples are associated with increased tumor size, advanced stage and PR absence. It’s noteworthy that the increased concentration levels of circulating miR-21 in plasma samples of metastatic breast cancer patients are correlated for the first time in bibliography both with short PFS and OS. In additional to, the increased concentration levels of circulating miR-146a and miR-210 in plasma samples are also associated for the first time with short PFS and OS, respectively, of metastatic breast cancer patients Concerning the CTC presence in the peripheral blood of breast cancer patients, the expression levels of miR21and miR-146a are higher in primary tumor tissues of CK-19 negative patients than CK-19 positive patients, while the expression levels of miR-31 are lower in CK-19 positive patients than CK-19 negative patients.Besides, the increased expression levels of miR-21 in primary tissues of CK-19 positive patients are associated with increased tumor size and ER/PR absence.The concentration levels of circulating miR-21 are higher in plasma samples of CK-19 positive patients than CK-19 negative patients, while the increased concentration levels of circulating miR-210 in plasma samples of CK-19 positive patients are associated with increased size of the primary tumor (>3cm).In conclusion, the results of the present study reinforce the view that circulating miRNAs are verypromising blood based biomarkers since their concentration is associated with clinical outcome ofcancer patients. The tissue specificity of certain miRNAs can be exploited in the cancer origin revelation using circulating miRNAs panels as diagnostic and prognostic tools. Additionally, the expression profile of miRNAs between primary tumor and plasma is not identical and this fact could be useful for the understanding of changes happening during cancer progression and metastasis. At last, it is notable that the concentration levels of circulating miRNAs can discriminate between early and metastatic cancer patients and are associated with the presence of metastasis in patients.

Τα κυκλοφορούντα miRNAs έχουν ελκύσει ιδιαίτερα το ενδιαφέρον της διεθνούς επιστημονικής κοινότητας ως πολλά υποσχόμενοι βιοδείκτες για τη διάγνωση, την πρόγνωση και την παρακολούθηση της θεραπείας ασθενών με καρκίνο.Το αυξανόμενο ενδιαφέρον για τον προσδιορισμό των επιπέδων συγκέντρωσής τους στο πλάσμα απαιτεί τη χρήση αξιόπιστων μεθοδολογιών ποσοτικού προσδιορισμού, όπως η RT-qPCR, αλλά και προσεκτικές θεωρήσεις σε προαναλυτικές και αναλυτικές παραμέτρους που αφορούν στην απομόνωσή τους από το πλάσμα, στη σταθερότητά τους και σε ζητήματα που σχετίζονται με την ποσοτικοποίησή τους. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αξιολογήθηκε η επίδραση 4 διαφορετικών πρωτοκόλλων απομόνωσης των κυκλοφορούντων miRNAs από το πλάσμα καθώς και η επίδραση των συνθηκών φύλαξης του πλάσματος στον ποσοτικό προσδιορισμό των κυκλοφορούντων miRNAs με τη χρήση της RT-qPCR. Η αξιολόγηση βασίσθηκε στα επίπεδα ανάκτησης εξωγενούς προτύπου γνωστής ποσότητας αλλά και ενδογενών miRNAs.Επιπλέον μελετήθηκε η σταθερότητα των απομονωμένων miRNAs κατά τη φύλαξή τους για μεγάλο χρονικό διάστημα και η επίδραση που έχει η μέθοδος της κανονικοποίησης των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από την RT-qPCR στον ποσοτικό προσδιορισμό των κυκλοφορούντων miRNAs.Η απομόνωση των κυκλοφορούντων miRNAs με τη χρήση στηλών μεμβράνης πυριτίου παρέχει μεγαλύτερη απόδοση και αξιοπιστία σε σύγκριση με τη χρήση του Trizol LS. Τα κυκλοφορούντα miRNAs εμφανίζουν μεγαλύτερη σταθερότητα κατά τη μακροχρόνια φύλαξη όταν τα δείγματα πλάσματος φυλάσσονται στους -70°C και σε αυτές τις συνθήκες τα απομονωμένα miRNAs διατηρούνται σταθερά για τουλάχιστον ένα χρόνο.Η κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων που βασίζεται στη συνδυαστική χρήση εξωγενούς προτύπου και ενδογενούς miRNA αναφοράς εξαλείφει με μεγάλη αξιοπιστία σφάλματα που οφείλονται στην ανάκτηση των κυκλοφορούντων miRNAs από το πλάσμα ή στην απόδοση της αντίδρασης σύνθεσης cDNA Ακολούθησε μελέτη και κλινική αξιολόγηση των κυκλοφορούντων miRNAs στο πλάσμα αλλά και στους αντίστοιχους πρωτοπαθείς όγκους σε δυο τύπους καρκίνου: στον καρκίνο του πνεύμονα και στον καρκίνο του μαστού. Οι τύποι αυτοί εμφανίζουν μεγάλη συχνότητα τόσο στον ελλαδικό χώρο όσο και παγκοσμίως με βάση τη διεθνή βιβλιογραφία. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης των miR-21, miR126*,miR-451, miR-30d, miR-10a και miR-30e-5p σε δείγματα πρωτοπαθών όγκων ασθενών με NSCLCκαθώς και στα αντίστοιχα δείγματα πλάσματος και ακολούθησε μελέτη της συσχέτισης των αποτελεσμάτων ώστε να διαπιστωθεί σε ποιο βαθμό τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs στον πρωτοπαθή όγκο αντικατοπτρίζονται στα επίπεδα συγκέντρωσης των κυκλοφορούντων miRNAs στο πλάσμα. Επιπλέον διεξήχθη και μελέτη της συσχέτισης των επιπέδων έκφρασης των miRNAs στον πρωτοπαθή όγκο και των επιπέδων συγκέντρωσης των κυκλοφορούντων miRNAs στο πλάσμα με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών, ενώ αξιολογήθηκε και η προγνωστική τους σημασία αναφορικά με το ελεύθερο νόσου διάστημα και την ολική επιβίωση των ασθενών.Τα επίπεδα έκφρασης των miR-451, miR-126* και miR-30d εμφανίζονται μειωμένα σε καρκινικούς ιστούς ασθενών με NSCLC σε σύγκριση με τους παρακείμενους μη καρκινικούς ιστούς, ενώ το miR-21 εμφανίζει αντιστοίχως αυξημένα επίπεδα έκφρασης. Επιπλέον, για πρώτη φορά βιβλιογραφικώς μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία τα επίπεδα έκφρασης των miR-10a και miR-30e-5p και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-30e-5p εμφανίζονται μειωμένα στους καρκινικούς ιστούς ασθενών με NSCLC σε σύγκριση με τους παρακείμενους μη καρκινικούς ιστούς, ενώ τα επίπεδα του miR-10a δεν διαφοροποιούνται.Τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του miR-21 στους πρωτοπαθείς όγκους των ασθενών με NSCLC συνδέονται με μικρό DFI και μικρό OS των ασθενών.Τα επίπεδα συγκέντρωσης του miR-21 είναι αυξημένα στο πλάσμα των ασθενών με NSCLC και συνδέονται με μικρό DFI και μικρό OS των ασθενών, ενώ τα επίπεδα συγκέντρωσης του miR-10a είναι μειωμένα και συνδέονται με μικρό DFI. Τέλος, το miR-30e-5p εμφανίζει αυξημένα επίπεδα συγκέντρωσης στο πλάσμα των ασθενών με NSCLC τα οποία σχετίζονται με μικρό OS.Σε δείγματα ασθενών με καρκίνο μαστού, πραγματοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισμός των miR-21, miR146a, miR-210, miR-31 και miR-200c στους πρωτοπαθείς όγκους και στα αντίστοιχα δείγματα πλάσματος από τους ίδιους ασθενείς. Ακολούθησε μελέτη της συσχέτισης των αποτελεσμάτων: α) μεταξύ των δυο βιολογικών υλικών, β) με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών και γ) με την ελεύθερη εξέλιξης επιβίωση (PFS) και την ολική επιβίωση των ασθενών (OS) και δ) με την παρουσία κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (CTCs) στο περιφερικό αίμα των ασθενών.Τα επίπεδα έκφρασης των miR-21, miR-146a, miR-210 & miR-200c είναι αυξημένα, ενώ τα επίπεδα έκφρασης του miR-31 είναι μειωμένα στους πρωτοπαθείς όγκους των ασθενών με καρκίνο μαστού σε σύγκριση με τους υγιείς ιστούς με τα επίπεδα έκφρασης των miR-21, miR-146a, miR-210 να είναι υψηλότερα στους ασθενείς με εγχειρήσιμο καρκίνο μαστού συγκριτικά με τους ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο μαστού.Τα επίπεδα έκφρασης του miR-31 είναι χαμηλότερα στους ασθενείς με επιβεβαιωμένη μετάσταση συγκριτικά με τους ασθενείς με εγχειρήσιμο καρκίνο μαστού.Tα αυξημένα επίπεδα έκφρασης των miR-21 και miR-146a σχετίζονται με την απουσία ER και PR υποδοχέων στους πρωτοπαθείς όγκους, ενώ τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης του miR-31 σχετίζονται με προχωρημένο στάδιο της νόσου. Τα επίπεδα συγκέντρωσης των miR-21, miR-146a και miR-210 είναι αυξημένα στο πλάσμα των ασθενών με καρκίνο μαστού σε σύγκριση με τους υγιείς αιμοδότες, ενώ τα αυξημένα επίπεδα συγκέντρωσης του κυκλοφορούντος miR-210 στο πλάσμα των ασθενών σχετίζονται με αυξημένο μέγεθος όγκου, προχωρημένο στάδιο της νόσου και απουσία PR υποδοχέων. Αξιοσημείωτο είναι ότι τα αυξημένα επίπεδα συγκέντρωσης του κυκλοφορούντος miR-21 στο πλάσμα συνδέονται για πρώτη φορά βιβλιογραφικώς τόσο με το PFS όσο και το OS των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο μαστού. Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα συγκέντρωσης του κυκλοφορούντος miR-146a στο πλάσμα συνδέονται για πρώτη φορά βιβλιογραφικώς με μικρό PFS, ενώ τα αυξημένα επίπεδα συγκέντρωσης του κυκλοφορούντος miR-210 με μικρό OS των ασθενών.Αναφορικά με την παρουσία CTCs στο περιφερικό αίμα των ασθενών με καρκίνο μαστού, τα επίπεδα έκφρασης του miR-21 και miR-146a είναι περισσότερο αυξημένα στους πρωτοπαθείς όγκους των CK-19 αρνητικών ασθενών σε σύγκριση με τους CK-19 θετικούς ασθενείς, ενώ τα επίπεδα έκφρασης του miR-31 είναι χαμηλότερα στους πρωτοπαθείς όγκους των CK-19 θετικών ασθενών σε σύγκριση με τους CK-19 αρνητικούς ασθενείς. Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του miR-21 στους πρωτοπαθείς όγκους των CK-19 θετικών ασθενών σχετίζονται με αυξημένο μέγεθος όγκου και με απουσία ER και PR υποδοχέων.Tα επίπεδα συγκέντρωσης του miR-21 είναι περισσότερο αυξημένα στο πλάσμα των CK-19 θετικών ασθενών σε σύγκριση με τους CK-19 αρνητικούς ασθενείς, ενώ τα αυξημένα επίπεδα συγκέντρωσης του miR-210 στο πλάσμα των CK-19 θετικών ασθενών σχετίζονται με το αυξημένο μέγεθος του πρωτοπαθούς όγκου (>3cm).Συμπερασματικά, από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας προκύπτει ότι τα κυκλοφορούνταmiRNAs αποτελούν πολλά υποσχόμενους βιοδείκτες καθώς η συγκέντρωσή τους συνδέεται με την κλινική έκβαση των ασθενών με καρκίνο. Η ιστοειδικότητα ορισμένων miRNAs μπορεί να αξιοποιηθεί στην αποκάλυψη της προέλευσης του καρκίνου, με τη χρήση ομάδων κυκλοφορούντων miRNAs(panels) ως διαγνωστικών και προγνωστικών εργαλείων. Επιπροσθέτως, το προφίλ έκφρασης τωνmiRNAs μεταξύ πρωτοπαθούς όγκου και πλάσματος δεν είναι απόλυτα ταυτόσημο γεγονός που μπορεί να αξιοποιηθεί στη μελέτη των αλλαγών που πραγματοποιούνται κατά τα στάδια εξέλιξης της νόσου και στην ανάπτυξη μεταστατικής εστίας. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα επίπεδα συγκέντρωσης των κυκλοφορούντων miRNAs μπορούν να διακρίνουν μεταξύ πρώιμου και μεταστατικού καρκίνου, ενώ τα επίπεδα συγκέντρωσης των κυκλοφορούντων miRNAs φαίνεται να σχετίζονται με την παρουσία μετάστασης