Ανάλυση της έκφρασης, μελέτη και κλινική αξιολόγηση των καλλικρεϊνών KLK13 και KLK15 στον καρκίνο του προστάτη

Abstract

Novel cancer biomarkers can tackle the discrepancies arising from the extensive utilization of PSA.Kallikrein-related peptidases (KLKs) form a multigene family that encodes for 15 secreted serine proteases, largely involved in the initiation and progression of human malignancies. Recent data describe the potential of miRNAs as novel promising cancer biomarkers. The aim of the present thesis was the expression analysis and clinical evaluation of KLK13, KLK15, and the KLK15-targeting miR-224 in prostate cancer.Malignant and benign prostate tissues were processed through homogenization. total RNA was extracted, polyadenylated (in the case of miRNA analyses) and reverse transcribed into cDNA. Firstly, the expression of both the classical and alternative mRNA transcripts of KLK13 and KLK15 was studied in prostate tissues and prostate cancer cell lines, via regular RT-PCR. Additionally, the protein expression of KLK13 was analyzed in prostate tissues via Western blotting immunoassays. The classical KLK13 and KLK15 mRNA transcripts, as well as miR224 expression levels, were further quantified, using Real-Time PCR, after the development, optimization and quality control assessment of the methodology. The effects of the chemotherapeutic compounds docetaxel andmitoxantrone on the viability of the androgen independent prostate cancer cell line DU145, were also assessed through the MTT and Trypan Blue methods. The modulation of the expression levels of KLK13 and KLK15 genes upon treatment with the aforementioned anticancer compounds was analyzed via qPCR. The clinical evaluation of the prognostic and the differential diagnostic potential of the biomolecules under study was accomplished by extensive biostatistical analyses (non parametric tests, ROC curve, Kaplan-Meier survival and univariate/multivariate Cox regression analyses).Expression analyses showed that the expression levels of, mainly, the classical mRNA transcripts are increased in prostate cancer compared to benign prostatic hyperplasia. By using an appropriate polycloncal antibody, KLK13 expression was detected in prostate tissues. Kaplan-Meier survival analysis showed that quantified KLK13 mRNA expression levels constitute a novel biomarker of disease progression for prostate cancer patients (p=0.015). KLK15 classical mRNA transcript levels, quantified via Real-Time PCR, were significantly increased in prostate cancer compared to benign prostatic hyperplasia patients (p<0,001) and were also associated with advanced pathological stages (p=0.023). Multivariate Cox regression analysis revealed that KLK15 expression is an independent predictor of disease recurrence in prostate cancer (HR=3.36, p=0.038).Conversely, miR-224 expression levels are decreased in prostate cancer compared to benign tumors (p<0.001).Additionally, a negative correlation was observed between miR-224 expression levels and both aggressive tumors (p=0,017) and advanced disease stages (p=0,018). Survival analysis showed that miR-224 is a novel biomarker of favorable prognosis for prostate cancer patients (p=0,021). Interestingly, a negative correlation was observed between miR-224 and KLK15 levels in cancerous prostate tumors (rs= -0,434, p<0.001). Furthermore, it was shown that the administration of the chemotherapeutic compounds docetaxel and mitoxantrone led to important modulations in the expression levels of KLK15 gene.The biomolecules that were studied represent promising molecular indicators that could aid in thedifferential diagnosis of and provide accurate prognostic ant treatment response predictive information for prostate cancer patients.

Η εισαγωγή νέων μοριακών δεικτών για τη διάγνωση και την πρόγνωση του καρκίνου του προστάτη θα μπορούσε να περιορίσει τα μειονεκτήματα που πηγάζουν από την εκτεταμένη χρήση του PSA. Οι καλλικρεΐνες αποτελούν μια οικογένεια από 15 γονίδια εκκρινόμενων πρωτεασών σερίνης που εμπλέκονται στην εξέλιξη των ανθρώπινων νεοπλασιών. Πρόσφατα δεδομένα παρουσιάζουν τα microRNAs (miRNAs) ως πολλά υποσχόμενους καρκινικούς δείκτες. Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως στόχο την ανάλυση της έκφρασης, τη μελέτη και την κλινική αξιολόγηση, των καλλικρεϊνών KLK13, KLK15 καθώς και του miR-224, που στοχεύει το γονίδιο KLK15,στον καρκίνο του προστάτη.Πραγματοποιήθηκε ομογενοποίηση καρκινικών και καλοηθών ιστών προστάτη, απομόνωση ολικού RNA και αντίστροφη μεταγραφή του RNA, έπειτα από πολυαδενυλίωση στην περίπτωση της ανάλυσης των miRNAs, σε cDNA. Σε πρώτο στάδιο, αναλύθηκε η έκφραση των κλασικών και εναλλακτικών μεταγράφων mRNA των γονιδίων KLK15 και KLK13, σε ιστούς και καρκινικές σειρές προστάτη, μέσω συμβατικής PCR, και πραγματοποιήθηκε ανοσοεντοπισμός της πρωτεΐνης KLK13 μετά από στύπωση Western. Ακολούθησε ανάλυση της έκφρασης των κλασικών mRNA μεταγράφων των γονιδίων KLK15 και KLK13, καθώς και του miR-224 σε ιστούς προστάτη μέσω ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο μετά από βελτιστοποίηση και κατάλληλο έλεγχο ποιότητας της μεθοδολογίας. Επιπρόσθετα, αναλύθηκε η επίδραση των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων, docetaxel και mitoxantrone στη βιωσιμότητα της ορμονοανεξάρτητης καρκινικής κυτταρικής σειράς προστάτη DU145, μέσω των μεθοδολογιών MTT και Trypan Blue, και στην έκφραση των κλασικών μεταγράφων mRNA των γονιδίων KLK13 και KLK15, μέσω qPCR. Η διερεύνηση της κλινικής αξίας των μελετώμενων βιομορίων πραγματοποιήθηκε μέσω εκτενούς βιοστατιστικής ανάλυσης (μη παραμετρικές δοκιμασίες, καμπύλες ROC, ανάλυση επιβίωσης κατά Kaplan-Meier, μονομεταβλητή-πολυμεταβλητή λογιστική παλινδρόμηση κατά Cox).Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι τα γονίδια KLK15 και KLK13 εκφράζονται σε αυξημένα επίπεδα στον καρκίνο του προστάτη σε σχέση με την καλοήθη προστατική υπερπλασία. Χρησιμοποιώντας κατάλληλο πολυκλωνικό αντίσωμα παρατηρήθηκε έκφραση της πρωτεΐνης KLK13 σε ιστούς προστάτη. Η έκφραση του γονιδίου KLK13 σε επίπεδο mRNA αποτελεί ένα δείκτη ευμενούς πρόγνωσης για τους ασθενείς με καρκίνο του προστάτη (p=0,015). Η ποσοτική ανάλυση της έκφρασης του κλασικού μεταγράφου του γονιδίου KLK15 έδειξε ότι η έκφρασή του είναι ιδιαίτερα αυξημένη στον καρκίνο του προστάτη (p<0,001), καθώς και σε όγκους προχωρημένου σταδίου (p=0,023). Η έκφραση του συγκεκριμένου μεταγράφου αποτελεί ένα νέο ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη για την εμφάνιση βιοχημικής υποτροπής (HR=3,36, p=0,038). Όσον αφορά το miR-224 παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων του στον καρκίνο του προστάτη (p<0,001). Παρατηρήθηκε μια στατιστικά σημαντική μείωση των επιπέδων του miR-224 σε περισσότερο επιθετικούς όγκους (p=0,017) και σε όγκους προχωρημένου σταδίου (p=0,018). Η ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι η παρουσία του miR-224 αποτελεί ένα νέο δείκτη ευμενούς πρόγνωσης (p=0,021). Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε μια ισχυρή αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων mRNA του γονιδίου KLK15 και των επιπέδων miR-224 στον καρκίνο του προστάτη (rs= -0,434,p<0,001). Επιπλέον, βρέθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου KLK15 αυξάνονται με τη χορήγηση αντικαρκινικών παραγόντων στην κυτταρική σειρά DU145.Τα μελετώμενα μόρια αντιπροσωπεύουν πολλά υποσχόμενους μοριακούς δείκτες που θα μπορούσαν να ενισχύσουν τη διαφοροδιάγνωση και να συμβάλλουν στην έγκυρη πρόγνωση και στην παρακολούθηση της θεραπευτικής ανταπόκρισης των ασθενών με καρκίνο του προστάτη.