Ανάλυση της έκφρασης και μελέτη της γονιδιακής ρύθμισης, μέσω μορίων μικρό RNA (miRNA), αποπτωτικών γονιδίων της BCL2 οικογένειας στην παιδική λευχαιμία

Abstract

Leukemia is a malignancy of the hematopoietic system, which consists of the infiltration of bone marrow from leukemic blasts, due to their continuous proliferation. The study of this disease is particularly important in children, as leukemia is the most common type of cancer observed during childhood, accounting for 29% of all childhood malignancies. Among leukemias, Acute Lymphoblastic leukemia (ALL) accounts for 76% of all childhood leukemic cases. During the last decades, there has been a tremendous progress concerning the diagnosis and therapy of ALL, as overall survival rates (OS) and disease-free survival rates (DFS) reach up to 90% and 80%, respectively, in developed countries. However, there are still challenges to overcome, as even with the establishment of modern therapeutic approaches, 20% of children experience relapse and poor prognosis with high mortality rates. Moreover, the therapeutic protocols of ALL stratify most patients in intermediate or high risk groups, leading often to patients’ overtreatment, which is followed by acute or late side effects. Therefore, apart from the clinically established prognostic markers, it is essential to identify new molecular markers, capable of early disease detection and precise patients’ prognosis, which will predict, as early as possible, the risk for relapse and patients’ response to treatment. The ultimate task is the development and the establishment of individualized and targeted therapeutic schemes, which will be based on the cytogenetic abnormalities and gene expression profile of each patient and will eliminate the side effects of chemotherapy treatment.Apoptosis deregulation, including the abnormal expression of its master regulators, BCL2 family genes, has been reported in various studies focused on leukemogenesis and has been correlated to patients’ outcome and resistance to chemotherapy. Thus, the discovery of the deregulated pathways and molecules involved in the upstream regulation of apoptosis and BCL2 family members, resulting in treatment failure and adverse prognosis, is of outmost importance. miRNAs represent an example of these molecules. They are a class of non-coding RNAs, 21-23bp, which regulate mainly post-transcriptionally other mRNAs. Researchers have revealed the implication of miRNAs in all aspects of the disease, from initiation and progression, to resistance to drugs and chemotherapy outcome in terms of relapse and death. Taking into account the potential of miRNAs as molecular markers of leukemia, the present Ph.D. Thesis performed, for the first time, the expression analysis and the evaluation of the clinical utility for childhood ALL of the miRNAs, miR-125b, miR-143, miR-182 and miR-195, which target BCL2 family genes, among others. The aim of the study was to reveal their potential as biomarkers in ALL differential diagnosis and in predicting patients’ treatment response and survival. MiR-125b has been the research topic of numerous studies that have focused on cancer, attributing to it either an oncogenic, or a tumor-suppressive role. It targets anti-apoptotic genes, such as BCL2, BLCW and MCL1, as well as proapoptotic genes, such as BAK1, BMF and TP53. Apart from its role in apoptosis, miR-125b promotes carcinogenesis through the induction of cellular proliferation and the inhibition of cellular differentiation. In leukemia, miR-125b can be found up - or downregulated, depending on the type of malignancy, while its abnormal expression has been linked to chemotherapy resistance. MiR-125b expression levels have been associated with the presence of specific cytogenetic abnormalities, as well as with resistance to vincristine and daunorubicin. Nevertheless, its value in differential diagnosis and in predicting disease outcome has not been estimated yet. MiR-182 plays a significant role in cellular physiology, as it is involved in the regulation of different pathways, including AKT/FOXO3A, p53, apoptosis, WNT and DNA repair. Studies in cancer have reported the deregulation of miR-182 expression, but there is not a common expression profile between different types of neoplasms. As a result, miR-182 functions either as a tumor-suppressive gene, by targeting BCL2, BCL2L12, RGS17 and CREB1, or as an oncogene, by targeting FOXO1, FΟΧO3, BRCA1, RsECK and MIM. However, there are not many studies focusing on the expression motif of this miRNA in hematological malignancies and correlating it with patients’ prognosis and outcome. MiR-143 has been reported to possess a tumor suppressive function, as it is often underexpressed in cancer, including leukemia, such as ALL, AML, CLL and Burkitt’s lymphoma. Normally, it is involved in the PI3K/Akt/mTOR pathway, inhibiting cellular proliferation and invasion, while it promotes apoptosis, by targeting ERK5, AKT, KRAS and BCL2 among others. Moreover, it regulates the epigenetic modification of genes, through the downregulation of DNMT3A expression. Despite the studies performed in leukemic samples and leukemic cell lines, which have revealed miR-143 reduced expression, its role in childhood ALL progression and in patients’ treatment response and survival, has not been reported yet. The last miRNA of this thesis was miR-195. In the majority of studies in cancer, miR-195 is downregulated and has been associated with poor prognosis. It is involved in cell cycle progression and apoptosis. Its gene targets, which support its tumor-suppressive role, include BCL2, BCLW, RAF1, CCND1, CCND3, CDK6 and E2F3, whose levels increase when miR-195 is underexpressed, inducing cell proliferation and impeding apoptosis. In leukemia, there are only a few studies which have presented roughly the expression pattern of miR-195, without however, attributing to it a specific role in disease formation and progression. To fulfill the aim of the study, a statistically significant number of bone marrow samples (272 in total) was collected and processed, from children with newly diagnosed ALL (N=125), from children of the same cohort at the end of the induction protocol (day 33) of treatment (N=83) and from children not suffering from any hematologic or other type of malignancy (N=64), which constituted the control group. The experimental procedures included the development and optimization of RNA extraction protocol from bone marrow samples, the spectrophotometric check of RNA quality and concentration, and the electrophoretic check for RNA degradation. Furthermore, polyadenylation and reverse transcription took place for the production of cDNA. To check the quality of all the aforementioned procedures, specific primers were designed and PCR reaction was optimized for the semi-quantitative evaluation of the reference gene SNOR48 and the studied miRNAs. Moreover, qReal-time PCR methodologies were developed for the quantification of the miRNAs of interest, using the fluorescent SYBR Green I assay. The expression analysis was carried out using the comparative CT, 2-ΔΔCT relative quantification method. The evaluation of the clinical significance of the studied miRNAs was performed by an extensive biostatistical analysis of the experiments’ results, using a detailed database of patients’ history, clinicopathological and follow-up data. The analysis of miR-125b revealed its significant downregulation in childhood ALL patients compared to the control group (p=0.004), and its ability to distinguish normal from leukemic BM samples (ROC curve AUC: 0.628; 95% CI 0.548–0.707; p=0.004 and univariate regression analysis OR: 0.477; 95% CI 0.288–0.790; p=0.004), independently of patients’ age and gender (OR:0.507; 95% CI 0.305–0.842; p=0.009). In addition, reduced miR-125b expression on disease diagnosis was correlated with unfavourable prognostic features, such as T-ALL and (p=0.037) and initial WBC≥50,000/μl (p=0.004). Moreover, decreased miR-125b levels on childhood ALL diagnosis were associated with significantly stronger risk for short-term relapse and poor OS of the treated patients, using Kaplan-Meier survival curves (p=0,005 and p=0.013, respectively) and univariate Cox regression analysis (HR: 4.253; 95% CI1.411–12.82; p=0.010 and HR: 3.072; 95% CI 1.209–7.806; p=0.018, respectively), while multivariate models confirmed miR-125b independent prognostic value for patients’ risk for relapse or death (HR: 3.891; 95% CI: 1.195–12.67; p=0.024 and HR: 2.963; 95% CI:1.079–8135; p=0.035, respectively). Interestingly, the downregulation of miR-125b on diagnosis was able to discriminate patients at higher risk for short-term relapse and worse survival outcome, despite the presence of favourable prognostic markers, such as B-cell immunophenotype (p=0.009 and p=0.003, respectively), initial WBC<50.000/μl (p=0.054 and p=0.047, respectively), good prednisone response on day 8 (p=0.003 and p=0.001, respectively) or M1 bone marrow response on day 15 of treatment (p<0.001 and p<0.001, respectively). Finally, patients with positive MRD on day 15 and low miR-125b levels on diagnosis presented a higher risk for relapse (p=0.010), while miR-125b downregulation on diagnosis identified a group of intermediate/high risk patients with also a higher risk for relapse or death (p=0.028 and p=0.010, respectively). At the end of the induction protocol (day 33), miR-125b was significantly upregulated compared to diagnosis in the majority (83%) of childhood ALL patients (p<0.001), while the higher values of day 33/diagnosis expression ratio were correlated with unfavourable prognostic markers, such as Τ-cell ALL (p=0.033), initial WBC≥50,000/μl (p=0.010), patients’ age <1 or ≥10 years old (p=0.025) and intermediate/high risk stratification according to ALL-IC BFM (p=0.003). In addition, increased miR-125b levels on the 33rd day were associated with significantly stronger risk for short-term relapse (p=0.016) and poor OS of the treated patients, (p=0.016), which was confirmed by univariate Cox regression analysis (HR: 4.218; 95% CI 1.174–15.16; p=0.027 and HR: 4.218; 95% CI 1.174–15.16; p=0.027, respectively). The same conclusion was extracted for patients with higher values of day 33/diagnosis expression ratio in terms of relapse and death probability using Kaplan-Meier survival curves (p=0,015 and p=0.004, respectively) and univariate Cox regression analysis (HR: 4.301; 95% CI 1.198–15.44; p=0.025 and HR: 6.789; 95% CI 1.517–30.37; p=0.012, respectively). Furthermore, the elevated values of day 33/diagnosis expression ratio were able to discriminate patients at higher risk for short-term relapse and worse survival outcome, despite the presence of favourable B-cell immunophenotype (p=0.001 and p<0.001, respectively), initial WBC<50.000/μl (p=0.051 and p=0.013, respectively), good prednisone response on day 8 (p=0.033 and p<0.001, respectively) or M1 bone marrow response on day 15 of treatment (p<0.001 and p<0.001, respectively). Finally, patients with positive MRD on day 15 and high miR-125b expression ratio levels presented increased risk for relapse (p=0.007) or death (p=0.003), while the augmented miR-125b expression ratio identified a group of intermediate/high risk patients with also higher risk for relapse or death (p=0.031 and p=0.007, respectively). Regarding miR-182, it was found to be significantly downregulated in childhood ALL patients compared to control (p<0.001) and to discriminate normal from leukemic BM samples (ROC curve 0.762; 95% CI 0.694–0.829; p<0.001 and univariate regression analysis OR: 0.221; 95% CI: 0.126 – 0.386; p<0.001), independently of patients’ age and gender (OR: 0.197; 95% CI 0.108–0.357; p<0.001). However, the expression of miR-182 on disease diagnosis did not correlate neither with patients’ clinicopathological data, nor with patients’ survival. At the end of the induction protocol (day 33), miR-182 was significantly upregulated compared to diagnosis in the vast majority (96%) of childhood ALL patients (p<0.001), while the higher values of day 33/diagnosis expression ratio were correlated with unfavourable prognostic markers, such as Τ-cell ALL (p=0.047), initial WBC≥50,000/μl (p=0.015) and intermediate/high risk stratification according to ALL-IC BFM (p=0.005). In addition, increased miR-182 levels on the 33rd day were associated with significantly stronger risk for short-term relapse (p=0.007) and poor OS of the treated patients, (p=0.044), which was confirmed by univariate Cox regression analysis for relapse (HR: 4.281; 95% CI: 1.339-13.69; p=0.014) and displayed a trend for death (HR: 2.928; 95% CI: 0.980-8.747; p=0.054).Moreover, higher expression levels of miR-182 on the 33rd day of treatment were associated to stronger risk for short-term relapse and dismal overall survival, despite the presence of favourable B-cell immunophenotype (p<0.001 and p<0.001, respectively), initial WBC<50.000/μl (p=0.027), good prednisone response on day 8 (p=0.006 and p=0.002, respectively) or M1 bone marrow response on day 15 of treatment (p<0.001 and p=0.004, respectively). Finally, patients with positive MRD on day 15 and higher miR-182 expression levels on day 33, presented increased risk for relapse (p=0.012) and a trend for death (p=0.068), while augmented miR-182 expression, also identified a group of intermediate/high risk patients with higher risk for relapse or death (p=0.012 and p=0.042, respectively). The expression analysis of miR-143 revealed its significant downregulation in childhood ALL patients compared to the control group (p<0.001), and its ability to distinguish normal from leukemic BM samples (ROC curve AUC: 0.880; 95% CI 0.831–0.928; p<0.001 and univariate regression analysis OR: 0.108; 95% CI: 0.056 – 0.207; p<0.001), independently of patients’ age and gender (OR: 0.098; 95% CI: 0.049 – 0.194; p<0.001). However, the expression of miR-143 on disease diagnosis did not correlate neither with patients’ clinicopathological data, nor with patients’ outcome. At the end of the induction protocol (day 33), miR-143 was significantly upregulated compared to diagnosis in the vast majority (91%) of childhood ALL patients (p<0.001), while its increased expression was associated with unfavourable prognostic markers, such as patients’ age <1 or ≥10 years old (p=0.023), positive MRD on the 33rd day (p=0.040) and intermediate/high risk stratification according to ALL-IC BFM (p=0.031). In addition, the higher values of miR-143 day 33/diagnosis expression ratio were also correlated with unfavourable prognostic markers, such as patients’ age <1 or ≥10 years old (p=0.046) and intermediate/high risk stratification according to ALL-IC BFM (p=0.012). Patients with overexpression of miR-143 on the 33rd day had a trend for stronger risk for disease relapse (p=0.196) and inferior OS (p=0.074), which was also shown in univariate Cox regression analysis for death (HR: 2.757; 95% CI: 0.864-8.802; p=0.087).As miR-195 is concerned, its levels were significantly downregulated in childhood ALL patients compared to the control group (p<0.001), and were able to discriminate normal from leukemic BM samples (ROC curve AUC: 0.820; 95% CI 0.761–0.880; p<0.001 and univariate regression analysis OR: 0.101; 95% CI: 0.048 – 0.212; p<0.001), independently of patients’ age and gender (OR: 0.842; 95% CI 0.740–0.959; p=0.009). However, the expression of miR-195 on disease diagnosis did not correlate neither with patients’ clinicopathological characteristics, nor with patients’ outcome. At the end of the induction protocol (day 33), miR-195 was significantly upregulated compared to diagnosis in the majority (89%) of childhood ALL patients (p<0.001), while the higher values of miR-195 day 33/diagnosis expression ratio were associated with unfavourable prognostic markers, such as patients’ age <1 or ≥10 years old (p=0.025), poor prednisone response on day 8 (p=0.007) and intermediate/high risk stratification according to ALL-IC BFM (p=0.002). Unfortunately, no statistical significant results were extracted, correlating miR-195 expression pattern on day 33 of treatment with patients’ survival data. When the evaluation of the clinical significance of each miRNA for patients’ outcome was completed, it was tested whether their combination in one common marker could offer an additional prognostic value, regarding patients’ survival. miR-125b showed a very strong and independent prognostic value as a lone marker, whereas, miR-195 did not correlate with patients’ outcome. The rest two miRNAs, namely miR-143 and miR-182, were combined to form a common marker, whose value was further examined on the 33rd day of treatment. Patients were divided in those expressing both miRNAs in low levels on day 33 and those overexpressing at least one miRNA. The overexpression of miR-143 and/or miR-182 on the 33rd day was associated with reduced disease-free (p=0.021) and overall survival (p=0.028) by Kaplan-Meier curves, which as also confirmed by univariate Cox regression analysis for relapse (HR: 4.911; 95% CI: 1.096-22.01; p=0.038) and death (HR: 4.590; 95% CI: 1.026-20.53; p=0.046). Moreover, multivariate Cox regression analysis confirmed the independent prognostic value of the combined miR-143/miR-182 marker for patients’ risk for relapse (HR: 6.907; 95% CI: 1.208-39.47; p=0.030). In addition, miR-143 and/or miR-182 overexpression was able to discriminate patients at higher risk for short-term relapse and dismal survival outcome, despite the presence of favourable B-cell immunophenotype (p=0.001 and p<0.001, respectively), good prednisone response on day 8 (p=0.027 and p<0.001, respectively), M1 bone marrow response on day 15 of treatment (p<0.001 and p=0.001, respectively) or patients’ age between 1-9 years old (p=0.041 for risk of death). Finally, patients with positive MRD on day 15 and higher miR-143/miR-182 expression levels on day 33, presented increased risk for relapse (p=0.009) or death (p=0.027), while the reduced levels of miR-143/miR-182 identified a group of intermediate/high risk patients with lower risk for relapse or death (p=0.022 and p=0.026, respectively) compared to patients presenting miR-143/miR-182 overexpression. Concluding, in the present Ph.D. Thesis, novel experimental methodologies were developed and optimized for the accurate and sensitive quantification of miRNAs in bone marrow samples from children suffering from ALL, as well as from healthy children. A statistically significant sample size of 272 samples in total was collected and processed and a detailed database of patients’ history, clincopathological and follow-up data was created for all patients. The extended biostatistical analysis revealed the significant clinical and prognostic value of miR-125b, miR-182 and of the combined marker miR-143/miR-182, and to a less extend of miR-143 and miR-195, for the differential diagnosis of ALL and the prediction of patients’ survival outcome. Finally, the study revealed the contribution of the expression pattern of the aforementioned miRNAs in ameliorating the predicting strength of the clinically established disease biomarkers, so that patients can be stratified in risk groups more accurately in order to receive the most suitable and efficient therapeutic regimen.

Η λευχαιμία αποτελεί νεοπλασία του αιμοποιητικού συστήματος, η οποία χαρακτηρίζεται από την πλήρωση του μυελού των οστών από βλάστες, λόγω του υπέρμετρου πολλαπλασιασμού τους. Η μελέτη της νόσου αυτής είναι ιδιαίτερα σημαντική στα παιδιά, καθώς η λευχαιμία καταλαμβάνει κυρίαρχη θέση, όσον αφορά τις κακοήθειες που εμφανίζονται κατά την παιδική ηλικία, αγγίζοντας το 29% των καρκίνων στα παιδιά. Ανάμεσα στις λευχαιμίες, η Οξεία Λεμφοβλαστική λευχαιμία (ΟΛΛ) αποτελεί των 76% των περιστατικών παιδικής λευχαιμίας. Αν και τα τελευταία χρόνια έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος τόσο στη διάγνωση, όσο και στη θεραπεία της λευχαιμίας, με ποσοστά ολικής επιβίωσης (OS) και επιβίωσης άνευ υποτροπής (DFS) που αγγίζουν το 90% και 80% αντίστοιχα στις ανεπτυγμένες χώρες, δεν παύουν να υφίστανται προκλήσεις. Ακόμη και με τις σύγχρονες θεραπευτικές μεθόδους, ένα στα πέντε παιδιά εμφανίζουν υποτροπή της νόσου και πτωχή πρόγνωση, ενώ στην περίπτωση της Οξείας Λεμφοβλαστικής λευχαιμίας, το φαινόμενο της υποτροπής οδηγεί σε υψηλά ποσοστά θνησιμότητας. Επιπλέον, τα θεραπευτικά πρωτόκολλα που ακολουθούνται κατατάσσουν την πλειονότητα των ασθενών στις ομάδες ενδιαμέσου ή υψηλού κινδύνου με αποτέλεσμα να εντοπίζονται συχνά φαινόμενα υπερθεραπείας (overtreatment) που συνοδεύονται από βραχυπρόθεσμες ή μακροπρόθεσμες ανεπιθύμητες ενέργειες.Επομένως, πέραν των προγνωστικών δεικτών που έχουν καθιερωθεί στην κλινική πράξη, δημιουργείται η ανάγκη μελέτης και η ταυτοποίησης νέων μοριακών δεικτών, ικανών για έγκαιρη διάγνωση και ακριβή πρόγνωση της νόσου, οι οποίοι θα μπορούν να προβλέψουν έγκαιρα την πιθανότητα υποτροπής κάθε ασθενούς, καθώς και την ανταπόκρισή τους στη χορηγούμενη χημειοθεραπεία. Απώτερος σκοπός είναι η ανάπτυξη και η καθιέρωση εξατομικευμένων και στοχευμένων θεραπευτικών σχημάτων, τα οποία εστιάζουν στην αντιμετώπιση των ιδιαίτερων κυτταρογενετικών ανωμαλιών και λαμβάνουν υπόψη το γονιδιακό προφίλ κάθε ασθενή, προσπαθώντας παράλληλα να ελαχιστοποιήσουν τις παρενέργειες από τα χημειοθεραπευτικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται στην καταπολέμηση της νόσου. Η απορρύθμιση της απόπτωσης, συμπεριλαμβανομένων και των γονιδίων της BCL2 οικογένειας που αποτελούν κύριους ρυθμιστές της, έχει αποδειχθεί σε πληθώρα μελετών που αφορούν τη λευχαιμογένεση και έχει συσχετιστεί με την πρόβλεψη της πορείας των ασθενών με ΟΛΛ, καθώς και με φαινόμενα ανθεκτικότητας στη χημειοθεραπεία. Κατ’ επέκταση, παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, η αποκάλυψη των ρυθμιστικών μηχανισμών ή μορίων που ευθύνονται για την αλλαγή των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων της BCL2 οικογένειας κι έχουν ως τελικό αποτέλεσμα την αποτυχία της θεραπείας και τη δυσμενή πορεία των ασθενών. Τέτοια μόρια αποτελούν τα microRNAs, μη κωδικά μόρια RNA μήκους 21-23 βάσεων περίπου, τα οποία ρυθμίζουν σε μεταμεταγραφικό κυρίως επίπεδο την έκφραση των μορίων mRNAs. Οι έρευνες που εστιάζουν στη λευχαιμία έχουν αποκαλύψει τη συμμετοχή των miRNAs σε όλες τις πτυχές της νόσου, από τη διάγνωση και την πρόβλεψη της πορείας των ασθενών, μέχρι την ανθεκτικότητα σε φάρμακα και την εκτίμηση του κινδύνου υποτροπής ή θανάτου. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, λαμβάνοντας υπόψη τη δυναμική που παρουσιάζουν τα miRNAs ως μοριακοί δείκτες στη λευχαιμία, αποφασίστηκε η ανάλυση της έκφρασης και η μελέτη της κλινικής αξίας των miRNAs, miR-125b, miR-143, miR-182 και miR-195 που στοχεύουν, μεταξύ άλλων, και γονίδια της οικογένειας BCL2, και εκτιμήθηκε για πρώτη φορά η κλινική τους αξία στην παιδική Οξεία Λεμφοβλαστική λευχαιμία. Σκοπός της μελέτης ήταν η αξιολόγησή τους ως βιολογικών δεικτών για τη διαφοροδιάγνωση της νόσου, για την ανταπόκριση των ασθενών με ΟΛΛ στη θεραπεία και για την πρόβλεψη της επιβίωσή τους. Το miR-125b έχει αποτελέσει το αντικείμενο μελέτης πληθώρας μελετών που εστιάζουν στη έρευνα του καρκίνου και του έχει αποδοθεί τόσο ογκογόνος, όσο και ογκοκατασταλτικός ρόλος. Ανάμεσα στα γονίδια στόχους του βρίσκονται τόσο τα αντι-αποπτωτικά BCL2, BLCW και MCL1, όσο και τα προαποπτωτικά BAK1, BMF και TP53. Πέραν του ρόλου του στην απόπτωση, το miR-125b προάγει την καρκινογένεση μέσω της επαγωγής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της παρεμπόδισης της κυτταρικής διαφοροποίησης. Στη λευχαιμία, το miR-125b έχει βρεθεί να υπερ- ή υποεκφράζεται ανάλογα με τον τύπο της κακοήθειας, ενώ παράλληλα η απορρύθμισή του έχει σχετιστεί με την ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Τα επίπεδά του στην ΟΛΛ έχουν συνδεθεί με την παρουσία συγκεκριμένων κυτταρογενετικών ανωμαλιών, καθώς και με την αντίσταση στην βινκριστίνη και δαουνορουβικίνη. Ωστόσο, δεν έχει εξεταστεί η αξία του ως διαφοροδιαγνωστικός δείκτης, ούτε η προγνωστική του αξία ως προς την ανταπόκριση των ασθενών στη θεραπεία και κατ’ επέκταση την επιβίωση τους. Το miR-182 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική φυσιολογία, καθώς εμπλέκεται στη ρύθμιση διαφόρων κυτταρικών μονοπατιών, όπως του AKT/FOXO3A, του p53, της απόπτωσης, του WNT και της επιδιόρθωσης του DNA. Οι μελέτες στον καρκίνο έχουν αποκαλύψει πως τα επίπεδα του miR-182 είναι συχνά απορρυθμισμένα, αλλά το προφίλ έκφρασής του δεν είναι κοινό μεταξύ διαφορετικών κακοηθειών. Ως αποτέλεσμα, το miR-182 άλλοτε δρα ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο, στοχεύοντας τα γονίδια BCL2, BCL2L12, RGS17 και CREB1, κι άλλοτε ως ογκογονίδιο, στοχεύοντας τα γονίδια FOXO1,FΟΧO3, BRCA1, RECK και MIM. Παρόλα αυτά, δεν υπάρχει μεγάλος αριθμός εργασιών που να εστιάζει στο προφίλ έκφρασης του συγκεκριμένου miRNA στις αιματολογικές κακοήθειες και να το συνδέει με προγνωστικούς παράγοντες και με την πορεία των ασθενών μετά την εφαρμογή θεραπείας. Το miR-143 υποστηρίζεται πως κατέχει ογκοκατασταλτική λειτουργία, καθώς εντοπίζεται μειωμένο στις κακοήθειες που έχει μελετηθεί, συμπεριλαμβανομένων των λευχαιμιών και λεμφωμάτων, όπως στην Οξεία Λεμφοβλαστική και Μυελογενή λευχαιμία, στη Χρόνια Λεμφοβλαστική λευχαιμία και στο λέμφωμα Burkitt. Φυσιολογικά, το miR-143 φαίνεται να συμμετέχει στο μονοπάτι PI3K/Akt/mTOR, αναστέλλοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη διήθηση, ενώ προωθεί τον κυτταρικό θάνατο, στοχεύοντας μεταξύ άλλων τα γονίδια ERK5, AKT, KRAS και BCL2. Επίσης, ρυθμίζει πιθανώς τη διαδικασία της επιγενετικής τροποποίησης γονιδίων μέσω καταστολής της έκφρασης του γονιδίου DNMT3A. Παρά τις έρευνες που έχουν πραγματοποιηθεί σε λευχαιμικά δείγματα ασθενών και λευχαιμικές κυτταρικές σειρές, οι οποίες έχουν αποκαλύψει την υποέκφραση του miR-143, δεν έχει μελετηθεί η έκφρασή του στην πορεία της θεραπείας, καθώς και ο ρόλος του στην πρόγνωση της ανταπόκρισης των ασθενών με παιδική ΟΛΛ στη χημειοθεραπεία και της επιβίωσής τους.Το τελευταίο miRNA που μελετήθηκε ήταν το miR-195. Στην συντριπτική πλειοψηφία των καρκίνων, όπου έχει μελετηθεί, το miR-195 παρουσιάζεται υποεκφρασμένο κι έχει σχετιστεί με δυσμενή πρόγνωση, ενώ τα κυριότερα μονοπάτια στα οποία εμπλέκεται είναι ο κυτταρικός κύκλος και η απόπτωση. Στα γονίδια στόχους του miRNA αυτού που υποστηρίζουν τον ογκοκατασταλτικό του ρόλο, συμπεριλαμβάνονται τα BCL2, BCLW, RAF1, CCND1, CCND3, CDK6 και E2F3, που αυξάνονται στην περίπτωση μείωσής της έκφρασής του, προωθώντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και καταστέλλοντας την απόπτωση. Στην λευχαιμία, έχουν πραγματοποιηθεί λίγες μελέτες, οι οποίες έχουν απλά παρουσιάσει μια αδρή εικόνα της έκφρασης του miR-195, χωρίς όμως να του έχουν αποδώσει κάποιον ιδιαίτερο ρόλο στην εκδήλωση της ασθένειας ή στην εξέλιξή της. Για την εκπόνηση της παρούσας διατριβής, συλλέχθηκε και αναλύθηκε στατιστικά σημαντικός αριθμός δειγμάτων μυελού των οστών (272) από παιδιά με Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία σε φάση διάγνωσης (125), αλλά και στο τέλος της θεραπείας εφόδου (83), καθώς και από παιδιά που δεν πάσχουν από λευχαιμία ή από οποιαδήποτε άλλη αιματολογική κακοήθεια που χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες της μελέτης (64). Οι πειραματικές διαδικασίες περιελάμβαναν την ανάπτυξη και βελτιστοποίηση πρωτοκόλλου απομόνωσης RNA από δείγματα μυελού των οστών, τον φασματοφωτομετρικό έλεγχο της ποιότητας και της συγκέντρωσής του και τον έλεγχο της ακεραιότητάς του με ηλεκτροφόρηση. Επιπλέον πραγματοποιήθηκαν διαδικασίες πολυαδενυλίωσης και αντίστροφης μεταγραφής για την παραγωγή του cDNA, καθώς και σχεδιασμός εκκινητών και βελτιστοποίηση της συμβατικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) για το γονίδιο αναφοράς SNOR48 και τα miRNAs μελέτης, προκειμένου να ελεγχθεί η ποιότητα όλων των παραπάνω πειραματικών διαδικασιών. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκε μεθοδολογία qReal-time PCR με τη χρήση του φθορισμογόνου SYBR Green I για να γίνει σχετική ποσοτικοποίηση της έκφρασης των miR-125b, miR-143, miR-182 και miR-195 στα δείγματα μυελού των οστών. Πριν την επεξεργασία του συνόλου των δειγμάτων της εργασίας, πραγματοποιήθηκαν πειράματα βελτιστοποίησης των συνθηκών κάθε αντίδρασης για κάθε miRNA ξεχωριστά, ώστε να επιτευχθεί η καλύτερη δυνατή απόδοση των πειραματικών διαδικασιών. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης πραγματοποιήθηκε με την μέθοδο σχετικής ποσοτικοποίησης 2-ΔΔCT. Η εκτίμηση της κλινικής αξίας των παραπάνω μορίων πραγματοποιήθηκε μέσω εκτενούς βιοστατιστικής ανάλυσης, η οποία συσχέτισε τα επίπεδα έκφρασής τους με τα κλινικοπαθολογικά δεδομένα των ασθενών και τη γενικότερη πορεία τους που καταγράφηκε σε πλήρη βάση δεδομένων. Η ανάλυση έκφρασης του miR-125b αποκάλυψε τη σημαντική μείωση των επιπέδων του στους ασθενείς με παιδική ΟΛΛ κατά τη διάγνωση σε σύγκριση με τους μάρτυρες της μελέτης (p=0.004) και την ικανότητά του στη διαφοροδιάγνωση των ασθενών με ΟΛΛ (καμπύλη ROC AUC: 0.628; 95% CI 0.548–0.707; p=0.004 και μονομεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης OR: 0.477; 95% CI 0.288–0.790; p=0.004). Επιπλέον, η διαφοροδιαγνωστική αξία της μείωσης των επιπέδων του miR-125b αποδείχθηκε ανεξάρτητη της ηλικίας και του φύλου των ασθενών (OR:0.507; 95% CI 0.305–0.842; p=0.009). Ακόμη, τα μειωμένα επίπεδα του miR-125b στη διάγνωση σχετίστηκαν με δυσμενείς δείκτες, όπως η Τ-ΟΛΛ (p=0.037) και τα WBC≥50,000/μl στη διάγνωση (p=0.004). Επίσης, η μείωση της έκφρασης του miR-125b στη διάγνωση, σχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής και θανάτου, τόσο από τις καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier (p=0,005 και p=0.013, αντίστοιχα), όσο και από τη μονομεταβλητή ανάλυση κατά Cox (HR: 4.253; 95% CI1.411–12.82; p=0.010 και HR: 3.072; 95% CI 1.209–7.806; p=0.018, αντίστοιχα), ενώ παράλληλα αναδείχθηκε η ανεξάρτητη κλινική αξία των επιπέδων του miR-125b στη διάγνωση της ΟΛΛ για την πρόβλεψη της υποτροπής ή θανάτου (πολυμεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης Cox HR: 3.891; 95% CI: 1.195–12.67; p=0.024 και HR: 2.963; 95% CI:1.079–8135; p=0.035, αντίστοιχα). Επιπλέον, αποκαλύφθηκε ότι οι ασθενείς με υποέκφραση του γονιδίου στη διάγνωση εμφάνισαν σημαντικά μειωμένο διάστημα επιβίωσης ελευθέρας νόσου (DFS) και ολικής επιβίωσης (OS), ακόμα και αν χαρακτηρίζονταν από ευνοϊκούς δείκτες, όπως από Β-ΟΛΛ ανοσοφαινότυπο (p=0.009 και p=0.003, αντίστοιχα), από αριθμό WBC<50,000/μl στη διάγνωση (p=0.054 και p=0.047, αντίστοιχα), από καλή απάντηση στην πρεδνιζόνη την 8η μέρα (p=0.003 και p=0.001, αντίστοιχα) και από απάντηση μυελού των οστών Μ1 την 15η μέρα θεραπείας (p<0.001 και p<0.001, αντίστοιχα). Τέλος, οι ασθενείς με θετική MRD την 15η μέρα και με χαμηλά επίπεδα του miR-125b παρουσίαζαν μεγαλύτερο κίνδυνο υποτροπής (p=0.010), ενώ η υποέκφραση του miR-125b στη διάγνωση, διέκρινε μια ομάδα ασθενών ενδιαμέσου ή υψηλού κινδύνου με μεγαλύτερο κίνδυνο υποτροπής και θανάτου (p=0.028 και p=0.010, αντίστοιχα).Την 33η μέρα της θεραπείας, τα επίπεδά του miR-125b αυξήθηκαν σε στατιστικά σημαντικό βαθμό σε σχέση με τη διάγνωση στην πλειονότητα (83%) των ασθενών με ΟΛΛ (p<0.001) και ο αυξημένος λόγος έκφρασης 33η μέρα/διάγνωση σχετίστηκε με μη ευνοϊκούς δείκτες της νόσου, όπως με Τ-ΟΛΛ (p=0.033), με WBC≥50,000/μl στη διάγνωση (p=0.010), με ηλικία <1 έτους ή ≥10 ετών (p=0.025) και με ενδιάμεσο/υψηλό βαθμό κινδύνου βάσει του πρωτοκόλλου ALL-IC BFM (p=0.003). Τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του miR-125b την 33η μέρα θεραπείας ήταν προγνωστικά μειωμένου διαστήματος επιβίωσης ελευθέρας νόσου (DFS) (p=0.016) και ολικής επιβίωσης (OS) (p=0.016), το οποίο επιβεβαιώθηκε και από την μονομεταβλητή παλινδρόμηση κατά Cox, για την υποτροπή (HR: 4.218; 95% CI 1.174–15.16; p=0.027), ή το θάνατο (HR: 4.218; 95% CI 1.174–15.16; p=0.027). Αυξημένες τιμές του λόγου έκφρασης 33η μέρα/διάγνωση, συνδέθηκαν επίσης με μεγαλύτερο κίνδυνο επανεμφάνισης της νόσου ή θανάτου, τόσο με καμπύλες Kaplan-Meier (p=0,015 και p=0.004, αντίστοιχα), όσο και με τη μονομεταβλητή ανάλυση κατά Cox (HR: 4.301; 95% CI 1.198–15.44; p=0.025 και HR: 6.789; 95% CI 1.517–30.37; p=0.012, αντίστοιχα) Ακόμη, υψηλότερες τιμές του λόγου έκφρασης 33η μέρα/διάγνωση του miR-125b σχετίστηκαν με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής και θανάτου των ασθενών, ακόμα και παρουσία ευνοϊκών δεικτών, όπως Β-ΟΛΛ ανοσοφαινότυπος (p=0.001 και p<0.001, αντίστοιχα), αριθμός WBC50,000/μl στη διάγνωση (p=0.051 και p=0.013, αντίστοιχα), καλή απάντηση στην πρεδνιζόνη την 8η μέρα (p=0.033 και p<0.001, αντίστοιχα) και απάντηση μυελού των οστών Μ1 την 15η μέρα θεραπείας (p<0.001 και p<0.001, αντίστοιχα). Τέλος, οι ασθενείς με θετική MRD την 15η μέρα και με αυξημένες τιμές του λόγου 33η μέρα/διάγνωση, παρουσίαζαν μεγαλύτερο κίνδυνο υποτροπής (p=0.007) ή θανάτου (p=0.003), ενώ οι υψηλότερες τιμές του λόγου 33η μέρα/διάγνωση του miR-125b διέκριναν μια ομάδα ασθενών ενδιαμέσου ή υψηλού κινδύνου με επίσης μεγαλύτερο κίνδυνο υποτροπής και θανάτου (p=0.031 και p=0.007, αντίστοιχα).Όσον αφορά το miR-182, αποκαλύφθηκε η στατιστικώς σημαντική υποέκφραση στους ασθενείς με παιδική ΟΛΛ σε σχέση με τους υγιείς ως προς τη νόσο (p<0.001) και η ικανότητά του στη διαφοροδιάγνωση των ασθενών με ΟΛΛ (καμπύλη ROC AUC: 0.762; 95% CI 0.694–0.829; p<0.001 και μονομεταβλητή ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης OR: 0.221; 95% CI: 0.126 – 0.386; p<0.001), ανεξαρτήτως ηλικίας και φύλου των ασθενών (πολυμεταβλητή ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης OR: 0.197; 95% CI 0.108–0.357; p<0.001). Ωστόσο, η προσπάθεια συσχέτισης των επιπέδων του miR-182 στη διάγνωση με τα κλινικοπαθολογικά δεδομένα των ασθενών και με την επιβίωσή τους, δεν αποκάλυψε κάποιο στατιστικώς σημαντικό αποτέλεσμα.Η ανάλυση της έκφρασης του miR-182 σε ασθενείς κατά την 33η μέρα της θεραπείας, έδειξε την στατιστικώς σημαντική αύξηση των επιπέδων του σε σχέση με τη διάγνωση στη συντριπτική πλειοψηφία (96%) τους (p<0.001) και ο λόγος έκφρασης 33η μέρα/διάγνωση σχετίστηκε με δυσμενή κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά της νόσου, όπως με Τ-ΟΛΛ (p=0.047), με WBC≥50,000/μl στη διάγνωση (p=0.015) και με ενδιάμεσο/υψηλό βαθμό κινδύνου βάσει του πρωτοκόλλου ALL-IC BFM (p=0.005). Επιπλέον, η υπερέκφραση του miR-182 την 33η μέρα θεραπείας ήταν ικανή να προβλέψει το μειωμένο διάστημα επιβίωσης ελευθέρας νόσου (DFS) (p=0.007) και ολικής επιβίωσης (OS) (p=0.044) σύμφωνα με τις καμπύλες Kaplan-Meier. Η μονομεταβλητή παλινδρόμηση κατά Cox επιβεβαίωσε το παραπάνω εύρημα για τον κίνδυνο υποτροπής (HR: 4.281; 95% CI: 1.339-13.69; p=0.014) και έδειξε μια ισχυρή τάση για τον κίνδυνο θανάτου (HR: 2.928; 95% CI: 0.980-8.747; p=0.054). Τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του miR-182 την 33η μέρα της θεραπείας σχετίστηκαν με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής και θανάτου των ασθενών, ακόμα και παρουσία ευνοϊκών δεικτών, όπως ο Β-ΟΛΛ ανοσοφαινότυπος (p<0.001 και p<0.001, αντίστοιχα), ο αριθμός WBC50,000/μl στη διάγνωση (p=0.027), η καλή απάντηση στην πρεδνιζόνη την 8η μέρα (p=0.006 και p=0.002, αντίστοιχα) και η απάντηση μυελού των οστών Μ1 την 15η μέρα θεραπείας (p<0.001 και p=0.004, αντίστοιχα). Τέλος, οι ασθενείς με θετική MRD την 15η μέρα και με αυξημένη έκφραση του miR-182 την 33η μέρα, παρουσίαζαν μεγαλύτερο κίνδυνο υποτροπής (p=0.012) και εμφάνισαν τάση για αυξημένο κίνδυνο θανάτου (p=0.068), ενώ η υπερέκφραση του miR-182 την 33η μέρα διέκρινε μια ομάδα ασθενών ενδιαμέσου ή υψηλού κινδύνου με μεγαλύτερο κίνδυνο υποτροπής και θανάτου σε σχέση με τους υπόλοιπους (p=0.012 και p=0.042, αντίστοιχα). Αναφορικά με το miR-143, τα επίπεδα του βρέθηκαν σημαντικά μειωμένα στους ασθενείς με παιδική ΟΛΛ κατά τη διάγνωση σε σύγκριση με τους μάρτυρες της μελέτης (p<0.001) και αναδείχθηκε η διαφοροδιαγνωστική ικανότητά του για τους ασθενείς με ΟΛΛ (καμπύλη ROC AUC: 0.880; 95% CI 0.831–0.928; p<0.001 και μονομεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης OR: 0.108; 95% CI: 0.056 – 0.207; p<0.001). Επιπλέον, η διαφοροδιαγνωστική αξία της μείωσης των επιπέδων του miR-143 αποδείχθηκε ανεξάρτητη της ηλικίας και του φύλου των ασθενών (OR: 0.098; 95% CI: 0.049 – 0.194; p<0.001). Ωστόσο, δεν αποκαλύφθηκε κάποια σημαντική συσχέτιση των επιπέδων του miR-143 στη διάγνωση με τα κλινικοπαθολογικά δεδομένα των ασθενών, αλλά ούτε και με την επιβίωσή τους.Η έκφραση του miR-143 κατά την 33η μέρα της θεραπείας αυξήθηκε σε στατιστικά σημαντικό βαθμό σε σχέση με τη διάγνωση στην πλειονότητα (91%) των ασθενών με ΟΛΛ (p<0.001) και υψηλότερα επίπεδά του παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με μη ευνοϊκά χαρακτηριστικά, όπως η ηλικία <1 έτους ή ≥10 ετών (p=0.023) και η θετική MRD την 33η μέρα (p=0.040) και σε ασθενείς της ομάδας ενδιαμέσου/υψηλού κινδύνου (p=0.031). Ο λόγος έκφρασης 33η μέρα/διάγνωση του miR-143 σχετίστηκε επίσης με δυσμενείς δείκτες της νόσου, όπως με ηλικία <1 έτους ή ≥10 ετών (p=0.046) και με ενδιάμεσο/υψηλό βαθμό κινδύνου βάσει του πρωτοκόλλου ALL-IC BFM (p=0.012). Οι ασθενείς με υπερέκφραση του γονιδίου την 33η μέρα εμφάνισαν μια τάση για λιγότερο ευνοϊκή επιβίωση άνευ υποτροπής (p=0.196) και ολική επιβίωση (p=0.074), η οποία τάση διαφαίνεται και στη μονομεταβλητή ανάλυση κατά Cox για τον θανάτου (HR: 2.757; 95% CI: 0.864-8.802; p=0.087). Για το miR-195, εντοπίστηκε η στατιστικώς σημαντική υποέκφραση του στους ασθενείς με παιδική ΟΛΛ σε σχέση με τους υγιείς ως προς τη νόσο (p<0.001) και η ανάλυση επιβεβαίωσε την διαφοροδιαγνωστική ικανότητα του miRNA για να διακρίνει τους ασθενείς από τους υγιείς, (καμπύλη ROC AUC: 0.820; 95% CI 0.761–0.880; p<0.001 και μονομεταβλητή ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης (OR: 0.101; 95% CI: 0.048 – 0.212; p<0.001) ανεξαρτήτως φύλου και ηλικίας (πολυμεταβλητή ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης OR: 0.842; 95% CI 0.740–0.959; p=0.009). Ωστόσο, η προσπάθεια συσχέτισης των επιπέδων του miR-195 στη διάγνωση με τα κλινικοπαθολογικά δεδομένα των ασθενών και με τον κίνδυνο υποτροπής ή θανάτου, δεν αποκάλυψε κάποιο στατιστικώς σημαντικό αποτέλεσμα.Η έκφραση του miR-195 κατά την 33η μέρα της θεραπείας, αυξήθηκε σε στατιστικά σημαντικό βαθμό σε σχέση με τη διάγνωση στην πλειονότητα (89%) των ασθενών με ΟΛΛ (p<0.001) και ο λόγος έκφρασης 33η μέρα/διάγνωση σχετίστηκε με δυσμενείς δείκτες της νόσου, όπως με ηλικία <1 έτους ή ≥10 ετών (p=0.025), με κακή απάντηση στην πρεδνιζόνη την 8η μέρα (p=0.007) και με ενδιάμεσο ή υψηλό βαθμό κινδύνου βάσει του πρωτοκόλλου ALL-IC BFM (p=0.002). Ωστόσο, όσον αφορά τη συσχέτιση του προφίλ έκφρασης του miR-195 την 33η μέρα με την πορεία των ασθενών, δεν προέκυψε κάποιο στατιστικώς σημαντικό αποτέλεσμα. Αφού ολοκληρώθηκε η αξιολόγηση της κλινικής αξίας των μεμονωμένων miRNAs για την επιβίωση των ασθενών με ΟΛΛ, ελέγχθηκε αν ο συνδυασμός τους σε έναν κοινό δείκτη θα μπορούσε να προσφέρει κάποια προγνωστική δυναμική αναφορικά με την πορεία των ασθενών. Δεδομένου ότι το miR-125b εμφάνισε από μόνο του πολύ ισχυρή και ανεξάρτητη προγνωστική αξία, ενώ το miR-195, δεν παρουσίασε από μόνο του κάποια κλινική αξία σχετική με την επιβίωση των ασθενών, τα δύο εναπομείναντα miRNAs, miR-143 και miR-182, συνδυάστηκαν σε ένα κοινό δείκτη, του οποίου εξετάστηκε η αξία την 33η μέρα της θεραπείας. Οι ασθενείς διακρίθηκαν σε εκείνους που παρουσίαζαν χαμηλή έκφραση και στα δύο γονίδια την 33η μέρα και σε εκείνους που παρουσίαζαν υπερέκφραση τουλάχιστον ενός εκ των δύο miRNAs. Έτσι, η υπερέκφραση του miR-143 ή/και του miR-182 την 33η μέρα του χημειοθεραπευτικού πρωτοκόλλου, σχετίστηκε με μικρότερο διάστημα επιβίωσης ελευθέρας νόσου (DFS) (p=0.021) και ολικής επιβίωσης (OS) (p=0.028), όπως προέκυψε από τις καμπύλες Kaplan-Meier και από την μονομεταβλητή ανάλυση Cox για τον κίνδυνο υποτροπής (HR: 4.911; 95% CI: 1.096-22.01; p=0.038) και θανάτου (HR: 4.590; 95% CI: 1.026-20.53; p=0.046) Επιπλέον, η πολυμεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης Cox ανέδειξε την ανεξαρτησία του συνδυασμένου δείκτη miR-143/miR-182 για την επανεμφάνιση της νόσου σε σχέση με καθιερωμένους κλινικούς δείκτες της ΟΛΛ (HR: 6.907; 95% CI: 1.208-39.47; p=0.030). Ακόμη, η υπερέκφραση του συνδυασμένου δείκτη miR-143/miR-182 ήταν ικανή να προβλέψει τη δυσμενή πορεία των ασθενών από άποψη πιθανότητας υποτροπής και θανάτου ακόμα και παρουσία ευνοϊκών προγνωστικών παραγόντων, όπως ο Β-ΟΛΛ ανοσοφαινότυπος (p=0.001 και p<0.001, αντίστοιχα), η καλή απάντηση στην πρεδνιζόνη την 8η μέρα (p=0.027 και p<0.001, αντίστοιχα), η απάντηση μυελού των οστών Μ1 την 15η μέρα θεραπείας (p<0.001 και p=0.001, αντίστοιχα) και ηλικία διάγνωσης μεταξύ 1-9 ετών, αν και εδώ το αποτέλεσμα ήταν στατιστικώς σημαντικό μόνο για τον κίνδυνο θανάτου (p=0.041). Ακόμη, οι ασθενείς με θετική MRD την 15η μέρα και με αυξημένα επίπεδα του miR-143/miR-182 την 33η μέρα της θεραπείας παρουσίαζαν σημαντικά μειωμένο διάστημα επιβίωσης ελευθέρας νόσου (DFS) και ολικής επιβίωσης (OS) (p=0.009 και p=0.027, αντίστοιχα). Τέλος, τονίστηκε η ικανότητα του συνδυασμένου δείκτη να βελτιώσει την ειδικότητα του συστήματος κατάταξης των ασθενών σε ομάδες κινδύνου, καθώς οι ασθενείς ενδιαμέσου ή υψηλού κινδύνου με ταυτόχρονη χαμηλή έκφραση και των δύο γονιδίων miR-143 και miR-182 χαρακτηρίζονταν από μικρότερο κίνδυνο υποτροπής ή θανάτου (p=0.022 και p=0.026, αντίστοιχα) και παρόμοιο με εκείνο των ασθενών χαμηλού κινδύνου, σε αντίθεση με τους ασθενείς ενδιαμέσου ή υψηλού κινδύνου με υπερέκφραση τουλάχιστον ενός εκ και των δύο γονιδίων.Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν νέες μεθοδολογίες προσδιορισμού των επιπέδων έκφρασης miRNA μορίων σε δείγματα μυελού των οστών, τόσο ασθενών με ΟΛΛ, όσο και υγιών παιδιών. Επεξεργάστηκαν συνολικά 272 δείγματα και δημιουργήθηκε λεπτομερής βάση των κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικών και της πορείας τους (follow-up) μετά την εφαρμογή του θεραπευτικού πρωτοκόλλου. Η βιοστατιστική ανάλυση ανέδειξε την κλινική και προγνωστική αξία των miR-125b, miR-182 και του συνδυασμένου δείκτη miR-182/miR-143 και σε μικρότερο βαθμό του miR-143 και miR-195 για τη διαφορική διάγνωση και πρόγνωση της έκβασης των ασθενών με ΟΛΛ. Τέλος, αποκαλύφθηκε η συμβολή τους στη βελτίωση της προβλεπτικής ικανότητας των καθιερωμένων κλινικών δεικτών της νόσου, ώστε να είναι εφικτή η ακριβέστερη ταξινόμηση των ασθενών σε ομάδες κινδύνου και να τους χορηγείται η καταλληλότερη και αποδοτικότερη θεραπεία.