Bacterial hydrolases of thermophilic origin and their application in plant biomass valorisation

Abstract

Τhe present thesis lies within the general framework of second generation biorefineries. Its subject specifically addresses the exploitation of thermophilic bacteria and their enzymes towards the bioconversion of lignocellulose to biofuels and other chemicals. In particular, it is focused on the study of the hydrolytic potential against cellulose and xylan of 103 thermophilic bacteria isolated from the volcanic habitat of Santorini (Meintanis, Chalkou et al. 2006). The majority of these strains belong to the genus Geobacillus and was able to degrade xylan, while only a few also presented cellulolytic activity (Stathopoulou, Galanopoulou et al. 2012).Within this context, the PhD thesis can be divided into four parts; the first three are interlinked since they are all related to the degradation of xylan and cellulose by the Santorini Geobacillus strains. In the last one - also related to cellulose degradation by Geobacilli - a different Geobacillus isolate is employed, G. stearothermophilus T-1, a strain for which the genome is known, the xylanolytic system is well studied and there are available genetic manipulation techniques for its transformation (Shulami, Zaide et al. 2007).Specifically, in the first part of the thesis, selected strains isolated from the volcanic habitat of Santorini were screened for genes encoding xylanolytic and cellulolytic enzymes. The screening of the desired genes was performed using polymerase chain reaction (PCR) and appropriately designed primers. Primer design was based in the conserved aminoacid regions of all the biochemically characterized xylanolytic and cellulolytic enzymes from Geobacilli and related strains, deposited in CAZy database (www.cazy.org). The outcome of this effort was the detection of two xylanases of the glycoside family GH10, three β-xylosidases of the glycoside families GH39, GH43 and GH52 respectively, one β-P-glucosidase of the glycoside family GH1 and one endoglucanase of the glycoside family GH5. Biochemical characterization of the enzymes validated their optimum xylanolytic or cellulolytic activities at neutral or slightly acid pH values. In addition, all enzymes presented significant thermostability at 60 and 65 ˚C while the maximum activity for all of them was observed at temperatures between 60 ˚C and. 70 ˚C.In the second part of the thesis, one xylanase of the glycoside family GH10, the β-xylosidase of the glycoside family GH52 and the endoglucanase GH5, all cloned and characterized in the previous part, were used to construct a tetravalent designer cellulosome able to act at elevated temperatures. A fourth complementary activity, that from the β-glucosidase of the bacterium Caldicellulosiruptor saccharolyticus (DSMZ 8903), was additionally employed. All four genes were combined with a dockerin domain, in order for the chimaeric products to interact with the corresponding cohesins of the cellulosome's scaffoldin. The resulted cellulosomal complex remained stable for at least 6 hours of incubation at 60 ˚C, while at the same time it hydrolyzed corn stover up to 66 % more efficiently compared to the free enzymes. The produced designer cellulosome, constitutes the first thermocellulosome characterised so far, confirming for the first time the feasibility of employing the designer cellulosome technology in biorefinery processes requiring elevated temperatures (Galanopoulou, Moraïs et al. 2016).The third part of the thesis concerns the genome analysis for one of the cellulolytic strains isolated from the volcanic habitat of Santorini, namely, ‘Geobacillus icigianus SP50’. We decided to further investigate this particular strain for two reasons; first, the cellulolytic phenotype is a rare trait, not well documented among Geobacilli. Second, ‘Geobacillus icigianus SP50’ was the only strain among the Geobacillus strains of Santorini, bearing the gene encoding for the endoglucanase of the glycoside hydrolase family GH5, already characterized in the first part of the thesis. Genome sequencing of ‘Geobacillus icigianus SP50’ allowed us to identify that the GH5 endoglucanase is a part of a genetic locus, unique in Geobacilli, that contains also four additional genes; a transcriptional regulator of the LacI family and three genes constituting together an ATP-dependent oligosaccharide transporter. We propose that all these, together with the GH5 endoglucanase, form a genetic cluster, which is responsible for the degradation and utilization of a broad range of β-D-glucans. Intriguingly, genes of this β-D-glucan utilization cluster, were not detected in any other Geobacillus genome while the neighboring regions were significantly conserved. In contrast though, some of the genes of the cluster were found conserved in representatives of other bacterial genera (Thermicanus aegyptius) and even families (Paenibacillus elgii), indicating that the cluster has possibly been acquired through horizontal gene transfer from phylogenetically distant bacteria.Finally, in line of exploiting the cellulolytic ability of Geobacillus strains, we attempted to transform the non-cellulolytic strain G. stearothermophilus T-1 to a cellulolytic one through heterologous expression of a cellulase from the thermophilic bacterium Thermobifida fusca YX. The procedure we chose was based on well-established transformation protocols of the strain using a derivative of the pNW33N plasmid (Zeigler 2001, Zeigler 2002, Shulami, Zaide et al. 2007). The resulted bifunctional phenotype could be of exceptional biotechnological interest since it could be incorporated in one-step biorefinery processes requiring elevated temperatures. The outcome of the thesis, raises questions that could be further examined:Regarding their enzymatic ability, it is already known that Geobacilli, besides xylanolytic hydrolases, produce a great variety of enzymes with auxiliary activities acting on hemicellulose. These enzymes, could be cloned and biochemically characterized in order to evaluate their contribution in lignocellulose degradation processes.The creation of functional designer thermocellulosomes, sets the basis for their incorporation in various biotechnological applications requiring elevated-temperatures. Among them, their incorporation in one-step biorefineries for ethanol production is of great interest and an ongoing project for our lab. Regarding the glucanolytic strain “Geobacillus icigianus SP50”, one of the immediate goals of our lab is to investigate the regulation of the β-glucan utilization cluster. In the same line, the genetically modified cellulolytic strain G. stearothermophilus T-1, could be incorporated in the hydrolysis of lignocellulosic substrates at elevated temperatures. To further improve the cellulolytic phenotype of the transformed G. stearothermophilus T-1 strain, we would like to attempt the introduction of the corresponding DNA cassette into the genome of the microorganism. Finally, it would be of great interest to develop the appropriate methodology for the genetic manipulation of the thermophilic strains isolated from the volcano of Santorini. In this way, the observed phenotype could be further investigated or appropriately modified for biotechnological purposes.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εντάσσεται στο γενικότερο πλαίσιο των βιοδιυληστηρίων δεύτερης γενιάς και ειδικότερα στην αξιοποίησης των θερμόφιλων μικροοργανισμών και των προϊόντων τους στη βιομετατροπή της λιγνοκυτταρινούχου βιομάζας σε βιοκαύσιμα και άλλα ενδιάμεσα χημικά. Πιο συγκεκριμένα, η εργασία εστιάστηκε στην υδρόλυση της κυτταρίνης και της ξυλάνης από 103 θερμόφιλα βακτηριακά στελέχη τα οποία συλλέχθηκαν από το ηφαίστειο της Σαντορίνης (Meintanis, Chalkou et al. 2006). Τα στελέχη αυτά στην πλειοψηφία τους ανήκουν στο γένος Geobacillus και εμφανίζουν ξυλανολυτική ικανότητα ενώ ορισμένα διαθέτουν επιπλέον την ικανότητα υδρόλυσης της κυτταρίνης (Stathopoulou, Galanopoulou et al. 2012).Υπό αυτό το πλαίσιο, η διδακτορική εργασία μπορεί να υποδιαιρεθεί σε τέσσερα επί μέρους τμήματα. Τα πρώτα τρία είναι αλληλένδετα μεταξύ τους και σχετίζονται με την αποικοδόμηση της κυτταρίνης και της ξυλάνης από τα στελέχη Geobacillus που απομονώθηκαν από το ηφαίστειο της Σαντορίνης. Στο τελευταίο τμήμα,-το οποίο επίσης σχετίζεται με την αποικοδόμηση της κυτταρίνης από τους γεωβάκιλλους,- επιλέξαμε ένα διαφορετικό στέλεχος, το στέλεχος G. stearothermophilus T-1, για το οποίο το γονιδίωμα είναι γνωστό, το ξυλανολυτικό του σύστημα είναι εκτενώς μελετημένο και επιπλέον έχουν ήδη αναπτυχθεί τα κατάλληλα εργαλεία μετασχηματισμού του (Shulami, Zaide et al. 2007).Ως σημείο αφετηρίας, επιλεγμένα στελέχη από το ηφαιστειακό ενδιαίτημα της Σαντορίνης ελέγχθηκαν για γονίδια που κωδικοποιούν κυτταρινολυτικά και ξυλανολυτικά ένζυμα. Ο εντοπισμός των επιθυμητών γονιδίων πραγματοποιήθηκε με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και χρήση κατάλληλων μορίων εκκινητών (primers). O σχεδιασμός των primers, βασίστηκε στις συντηρημένες περιοχές της αμινοξικής αλληλουχίας όλων των βιοχημικά χαρακτηρισμένων ξυλανολυτικών και κυτταρινολυτικών ενζύμων του γένους Geobacillus αλλά και συγγενικών ειδών τα οποία βρίσκονται κατατεθειμένα στη βάση δεδομένων CAZy (www.cazy.org). Η παραπάνω πορεία, οδήγησε στον εντοπισμό δύο ξυλανασών της οικογένειας γλυκοσιδικών υδρολασών (GH) 10, τριών β-ξυλοσιδασών των οικογενειών GH39, GH43 και GH52, μίας β-P-γλυκοζιδάσης της οικογένειας GH1, και μίας ενδογλυκανάσης της οικογένειας GH5. Ο βιοχημικός χαρακτηρισμός των ενζύμων αυτών, επιβεβαίωσε την αντίστοιχη ξυλανολυτική ή κυτταρινολυτική τους δράση. Επιπλέον, φάνηκε πως τα ένζυμα αυτά δρουν σε ουδέτερο έως ελαφρώς όξινο περιβάλλον, παρουσιάζουν ιδιαίτερη θερμοσταθέροτητα στους 60 και 65 ˚C ενώ εμφανίζουν μέγιστη ενεργότητα μεταξύ 60 ˚C και 70 ˚C. Στο δεύτερο τμήμα της διδακτορικής διατριβής, η μία ξυλανάση GH10, η β-ξυλοζιδάση GH52 και η ενδογλυκανάση GH5 που κλωνοποιήθηκαν στο προηγούμενο στάδιο της διδακτορικής διατριβής και επιπλέον μία β-γλυκοζιδάση από το βακτήριο Caldicellulosiruptor saccharolyticus (DSMZ 8903) χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ενός κυτταρινοσώματος ικανού να δρά σε υψηλές θερμοκρασίες. Στα ένζυμα αυτά εισήχθηκε μια εξειδικευμένη επικράτεια αγκίστρωσης (dockerin) έτσι ώστε το προκύπτον χιμαιρικό ένζυμο να είναι ικανό να προσδεθεί στην αντίστοιχη επικράτεια σύνδεσης (cohesin) της πρωτεΐνης στήριξης (scafoldin) του κυτταρινοσώματος. Το σύμπλοκο που προέκυψε, αποδείχτηκε ότι παραμένει σταθερό στους 60 ˚C για τουλάχιστον έξι ώρες επώασης και οτι στο συγκεκριμένο χρονικό διάστημα, υδρολύει το άχυρο καλαμποκιού έως και 66% πιο αποδοτικά σε σύγκριση με τα αντίστοιχα ελεύθερα ένζυμα.(Galanopoulou, Moraïs et al. 2016). H παρούσα εργασία παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς περιγράφει για πρώτη φορά την κατασκευή θερμοκυτταρινοσωμάτων και αποδεικνύει την λειτουργικότητα τους (Galanopoulou, Moraïs et al. 2016).Τα παραπάνω ανοίγουν το δρόμο για την αξιοποίηση των δομών αυτών σε βιοτεχνολογικές εφαρμογές που απαιτούν υψηλές θερμοκρασίες.Το τρίτο μέρος της παρούσας εργασίας αφορά στην ανάλυση του γονιδιώματος ενός από τα απομονωθέντα στελέχη του ηφαιστείου της Σαντορίνης, του στελέχους “Geobacillus icigianus SP50”. Η μελέτη του συγκεκριμένου στελέχους, παρουσιάζει ενδιαφέρον για δύο λόγους: Αρχικά, ο κυτταρινολυτικός φαινότυπος είναι σπάνιος και όχι καλά μελετημένος για το γένος των γεωβακίλλων. Δεύτερον, το στέλεχος “Geobacillus icigianus SP50” ήταν το μοναδικό στη συλλογή, στο οποίο εντοπίστηκε το γονίδιο της ενδογλυκανάσης GH5 που χαρακτηρίστηκε στο πρώτο μέρος της εργασίας. Από την ανάλυση του γονιδιώματος του εν λόγω στελέχους, εκτός από το γονίδιο της GH5 κυτταρινάσης, εντοπίστηκαν τέσσερα επιπλέον γονίδια: το γονίδιο ενός μεταγραφικού ρυθμιστή της οικογένειας LacI καθώς και τρία γονίδια τα οποία κωδικοποιούν για έναν ΑTP-εξαρτώμενο μεταφορέα ολιγοσακχαριτών. Προτείνουμε πως αυτά τα πέντε γονίδια μαζί αποτελούν μία ομάδα γονιδίων υπεύθυνη για την αποικοδόμηση και πρόσληψη ενός μεγάλου εύρους β-D-γλυκανών από τα κύτταρα. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα επιμέρους γονίδια της συγκεκριμένης ομάδας, δεν εντοπίστηκαν σε κανένα άλλο γονιδίωμα του γένους Geobacillus ενώ αντίθετα, σημαντικά συντηρημένα εμφανίστηκαν στο γονιδίωμα αντιπροσώπων διαφορετικών βακτηριακών γενών (Thermicanus aegyptius) αλλά και οικογενειών (Paenibacillus elgii). Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η συγκεκριμένη ομάδα γονιδίων ενσωματώθηκε, πιθανά, στο γονιδίωμα του ‘Geobacillus icigianus SP50’ μέσω οριζόντιας μεταφοράς.Tέλος και το τελευταίο κομμάτι της διδακτορικής διατριβής, επικεντρώθηκε στη διάσπαση της κυτταρίνης από το γένος Geobacillus. Πιο συγκεκριμένα, επιχειρήθηκε η μετατροπή του μη κυτταρινολυττικού στελέχους G. stearothermophilus T-1 σε κυτταρινολυτικό μέσω ετερόλογης έκφρασης μίας κυτταρινάσης του βακτηρίου Thermobifida fusca YX. Η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε βασίστηκε σε πρωτόκολλα μετασχηματισμού του συγκεκριμένου στελέχους με ένα παράγωγο του πλασμιδιακού φορέα pNW33N (Zeigler 2001, Zeigler 2002, Shulami, Shenker et al. 2014). Ο προκύπτον μικτός φαινότυπος είναι ιδιαίτερης βιοτεχνολογικής σημασίας καθώς μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε υψηλής θερμοκρασίας βιομετατροπές ενός σταδίου.Από το σύνολο των επιμέρους τμημάτων της διατριβής που αναλύθηκαν παραπάνω, θεωρούμε ότι προκύπτουν ερωτήματα που χρήζουν περαιτέρω μελέτης:Σε ενζυμικό επίπεδο, είναι γνωστό ότι οι γεωβάκιλοι διαθέτουν μία πληθώρα ενζύμων τα οποία δρουν βοηθητικά στην αποικοδόμηση της ημικυτταρίνης. Τα ένζυμα αυτά θα μπορούσαν να κλωνοποιηθούν και να χαρακτηριστούν βιοχημικά έτσι ώστε να εκτιμηθεί η συνεργιστική δράση τους στην αποτελεσματικότερη αποικοδόμηση της λιγνοκυτταρίνης.Η δημιουργία των θερμοκυτταρινοσωμάτων και η αποτελεσματική ικανότητα υδρόλυσης αυτών σε υψηλές θερμοκρασίες, επιτρέπει την εξαγωγή μίας σειράς υποθέσεων οι οποίες θα μπορούσαν να εξεταστούν. Μεταξύ αυτών, ιδιαίτερο ενδιαφέρον για το εργαστήριο μας, έχει η ένταξη τους σε βιοδιυλιστήρια ενός σταδίου για την παραγωγή αιθανόλης.Όσον αφορά το κυτταρινολυτικό στέλεχος ‘Geobacillus icigianus SP50’, ένας από τους άμεσους στόχους μας είναι η διερεύνηση της ρύθμισης έκφρασης της β-D-γλυκανολυτικής ομάδας. Στην ίδια κατεύθυνση, θα μπορούσε να ενταχθεί το γενετικά τροποποιημένο στέλεχος G. stearothermophilus T-1 για τη χρήση του σε διεργασίες υδρόλυσης της λιγνοκυτταρίνης ενός σταδίου. Ως προς την περαιτέρω βελτιστοποίηση του στελέχους, άμεσος στόχος είναι η ενσωμάτωση του υπεύθυνου τμήματος DNA για τον διάσπαση της κυτταρίνης, στο γονιδίωμα του μικροοργανισμού. Τέλος, ιδιαίτερο ενδιαφέρον θα είχε η ανάπτυξη της κατάλληλης μεθοδολογίας για το γενετικό χειρισμό των βακτηριακών στελεχών τα οποία έχουν απομονωθεί από το ηφαίστειο της Σαντορίνης έτσι ώστε να μελετηθεί εκτενέστερα ο υπάρχον φαινότυπός τους ή να τροποποιηθεί επιπλέον έτσι ώστε να ενταχθούν σε διάφορες βιοτεχνολογικές διεργασίες.