Απομόνωση και καθορισμός του γενότυπου αντοχής Gram-αρνητικών βακτηρίων από ωτίτιδα σκύλου ανθεκτικών στα νεότερα β-λακταμικά αντιμικροβιακά και τις φθοριοκινολόνες

Abstract

The aim of this study was to isolate Gram-negative bacteria from canine otitis cases and to investigate the prevalence and mechanisms of their FQ and ESC resistance. Susceptibilities of Gram-negative bacteria to the quinolone nalidixic acid, to FQs (ciprofloxacin, enrofloxacin, marbofloxacin and pradofloxacin), to β-lactams (ampicillin, amoxicillin-clavulanic acid, piperacillin-tazobactam, cefoxitin, cefuroxime, ceftazidime, cefoperazone, ceftriaxone, cefotaxime, cefepime, aztreonam, imipenem and meropenem) and to other antimicrobials were initially evaluated by the disc diffusion method according to CLSI and EUCAST recommendations. The MICs of nalidixic acid, ciprofloxacin, enrofloxacin, marbofloxacin and pradofloxacin against all otitis isolates were determined and interpreted by the broth microdilution method according to CLSI criteria, except for pradofloxacin where the interpretation was based on the recommendations of EMEA. Furthermore, the MICs against selected E. coli isolates were also calculated in the presence of the efflux-pump inhibitor in order to determine efflux-pump overexpression. The presence of PMQR genes (qnrA, qnrB, qnrS, aac(6′)-Ib-cr, oqxA, oqxB and qepA) in all isolates was screened by PCR assays and sequencing. Isolates being resistant to all four FQs tested or exhibiting resistance only to one FQ agent or carrying PMQR gene(s) were investigated for mutations in fragments including, but not limited to, the quinolone resistance-determining region (QRDR) of FQ-target enzymes DNA gyrase and topoisomerase IV. Furthermore, the persistent mechanisms of ESC resistance in three clinical and seven fecal multidrug-resistant (MDR) E. coli isolates from a dog suffering from recurrent otitis, treated with FQs and β-lactam-inhibitor, and colonized for a long period, were characterized. Specifically, MICs were determined by broth microdilution method. β-lactamase phenotypes were screened by DDST, TDT, BA and isoelectric focusing. Screening for β-lactamases (pAmpCs and ESBLs) was performed, and PCR-positive isolates were reamplified and sequenced for entire genes. Conjugation experiments, PCR-based replicon-typing, plasmid-MLST were performed for plasmid characterization. Genetic environment of bla genes was determined by PCR-mapping. The genetic relatedness of the isolates was characterized by MLST, ERIC2-PCR and PFGE. Moreover, the ESC-resistance mechanism of a P. mirabilis otitis isolate harboring the blaCMY-2 gene chromosomally located was analyzed. MICs were determined by broth microdilution method. Phenotypic tests were combined with genotypic analyses (PCRs, sequencing, conjugation experiments, S1 nuclease PFGE, and PCR mapping), and chromosomal versus plasmid location of bla genes was assessed by I-CeuI analysis. Finally, two E. cloacae otitis isolates were evaluated for induction or hyperproduction of AmpC synthesis. MICs were determined by broth microdilution method and the AmpC induction was based on the disk approximation (D-test) assay.

Σκοπός της διατριβής ήταν η απομόνωση Gram-αρνητικών στελεχών από περιστατικά ωτίτιδας στο σκύλο ανθεκτικών σε ευρέος φάσματος αντιμικροβιακά, συγκεκριμένα στις φθοριοκινολόνες και στα νεότερα β-λακταμικά αντιμικροβιακά, η διερεύνηση και ο καθορισμός του γενότυπου αντοχής τους με κύριο στόχο τη μελέτη του επιπολασμού και της διασποράς των γενετικών τους στοιχείων αντοχής. Όλα τα Gram-αρνητικά στελέχη που απομονώνονταν εξετάζονταν καταρχήν με τη μέθοδο Kirby-Bauer ως προς την αντοχή τους στο ναλιδιξικό οξύ, στις φθοριοκιονολόνες (σιπροφλοξακίνη, ενροφλοξακίνη, μαρμποφλοξακίνη και πραδοφλοξακίνη), στα β-λακταμικά αντιμικροβιακά (αμπικιλλίνη, αμοξυκιλλίνη-κλαβουλανικό οξύ, πιπερακιλλίνη-ταζομπακτάμη, κεφοξιτίνη, κεφουροξίμη, κεφταζιδίμη, κεφοπεραζόνη, κεφτριαξόνη, κεφοταξίμη, κεφεπίμη, αζτρεονάμη, ιμιπενέμη και μεροπενέμη) και σε άλλα αντιμικροβιακά σύμφωνα με τις συστάσεις του CLSI και του EUCAST. Ακολούθως, σε όλα τα ωτικά στελέχη προσδιορίστηκε η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (MIC) του ναλιδιξικού οξέος και των φθοριοκινολονών, σιπροφλοξακίνη, ενροφλοξακίνη, μαρμποφλοξακίνη και πραδοφλοξακίνη με τη μέθοδο των διαδοχικών μικροαραιώσεων. Επιπλέον, σε επιλεγμένα στελέχη της Ε. coli υπολογίστηκε η MIC των φθοριοκινολονών, παρουσία ενός αναστολέα αντλίας εκροής, με σκοπό τον καθορισμό της υπερέκφρασης της αντλίας εκροής. Όλα τα στελέχη που απομονώθηκαν εξετάστηκαν με τεχνικές της PCR για την ανίχνευση των PMQR γονιδίων. Ακολούθως, όλα τα στελέχη που εμφάνιζαν αντοχή σε όλες τις φθοριοκινολόνες που εξετάστηκαν ή αντοχή μόνο σε μία φθοριοκινολόνη ή που έφεραν PMQR γονίδιο(α), εξετάστηκαν με τεχνικές της PCR, για την ενίσχυση τμημάτων των γονιδίων, συμπεριλαμβανομένης της QRDR περιοχής, για την ανίχνευση των μεταλλάξεων στα ένζυμα στόχους (DNA γυράση και τοποϊσομεράση IV) των φθοριοκινολονών. Επιπρόσθετα, ανιχνεύτηκαν και χαρακτηρίστηκαν οι μηχανισμοί αντοχής στις εκτεταμένου φάσματος κεφαλοσπορίνες σε τρία κλινικά στελέχη και σε επτά στελέχη κοπράνων της E. coli που παρουσίαζαν πολυανθεκτικότητα και τα οποία είχαν απομονωθεί από σκύλο που έπασχε από υποτροπιάζουσα ωτίτιδα και στον οποίο είχαν χορηγηθεί φθοριοκινολόνες και αναστολέας των β-λακταμών με αποτέλεσμα να αποικιστεί για μεγάλο χρονικό διάστημα. Ο προσδιορισμός της MIC έγινε με τη μέθοδο των διαδοχικών μικροαραιώσεων. Η φαινοτυπική ανίχνευση της παραγωγής των β-λακταμασών διενεργήθηκε με τη δοκιμή συνέργειας του διπλού δίσκου, τη δοκιμή των τριών-διαστάσεων, τη δοκιμή βορονικού οξέος και με την αναλυτική ισοηλεκτρική εστίαση. Όλα τα στελέχη της E. coli εξετάστηκαν με τεχνικές της PCR με σκοπό την ανίχνευση των γονιδίων που κωδικοποιούν AmpCs και ESBLs. Η μεταβίβαση των bla γονιδίων μέσω πλασμιδίων μελετήθηκε με την εφαρμογή πειραμάτων σύζευξης. Η ταυτοποίηση των πλασμιδίων έγινε με τις μεθόδους PCR-based-replicon-typing, S1-νουκλεάση-PFGE και plasmid-multilocus sequence typing. Το γενετικό περιβάλλον των bla γονιδίων καθορίστηκε με PCR χαρτογράφηση. Ο προσδιορισμός της γενετικής σχέσης των στελεχών της E. coli έγινε με τις μεθόδους multilocus sequence typing, ERIC2 PCR και Pulsed Field Gel Electrophoresis. Επιπλέον, αναλύθηκαν οι μηχανισμοί αντοχής στις εκτεταμένου φάσματος κεφαλοσπορίνες σε κλινικό ωτικό στέλεχος του P. mirabilis που έφερε χρωμοσωμικά εντοπισμένο blaCMY-2 γονίδιο. Ο προσδιορισμός της MIC έγινε με τη μέθοδο των διαδοχικών μικροαραιώσεων. Η φαινοτυπική ανίχνευση της παραγωγής των β-λακταμασών συνδυάστηκε με τις γενοτυπικές αναλύσεις (PCRs, ανάλυσης της αλληλουχίας, πειράματα σύζευξης, S1-νουκλεάση-PFGE και PCR χαρτογράφηση), η χρωμοσωμική έναντι της πλασμιδιακής εντόπισης εκτιμήθηκε με τη διεξαγωγή της I-CeuI ανάλυσης. Τέλος, σε δύο στελέχη του E. cloacae που παρουσίαζαν αντοχή στους αναστολείς των β-λακταμασών και στις κεφαμυκίνες έγινε έλεγχος παραγωγής επαγώγιμων ή σταθερά παραγόμενων AmpC β-λακταμασών. Ο προσδιορισμός της MIC έγινε με τη μέθοδο των διαδοχικών μικροαραιώσεων και εφαρμόστηκε το D-test με σκοπό τη φαινοτυπική ανίχνευση της παραγωγής των επαγώγιμων β-λακταμασών.