Εδαφική μικροβιακή ποικιλότητα και βλάστηση σε μεσογειακά οικοσυστήματα

Abstract

Background Soil microbes are basic components of terrestrial ecosystems contributing in the decomposition of organic matter and in the recycling of nutrients, having central role in biogeochemical cycles, such as the nitrogen cycle. Despite their central role, the driving forces of their spatial patterns are still widely unknown and it constitutes the basic limitation for their incorporation in management practices of non-cultivated soils.Targets In this thesis a) the study of the relative abundance of ammonia-oxidizing microorganisms (AOA, AOB), b) the study of their genetic diversity patterns, c) the study of genetic diversity of bacteria communities, d) the study of the potential uses of third generation microarrays and e) the study of the phylogenetic relationships of soil microbes are attempted.Methodology Focusing on different NATURA2000 habitat types, the study of soil microbes was based on culture independent techniques, while soil and vegetation data of each habitat type were also collected and incorporated in the analyses. TRFLP analysis was selected as a rapid, sensitive and highly reproducible technique, which is robust for comparative studies. For the TRFLP analysis PCR amplification of the amoA and 16S rRNA genes was performed, while abundances of the amoA gene were determined by real-time PCR. The PhyloChip (G3) of the Affymetrix Inc has been selected for further test.Results According to the results of quantitative PCR, archaeal amoA genes outnumbered and predominated over bacterial amoA genes in ground of all studied areas. The genetic diversity of AOM based on amoA gene, as well as the genetic diversity of soil bacteria communities based on 16S rRNA gene are not differentiated according to the NATURA2000 habitat classification scheme. In several cases, woody plant families in a special relationship with altitude contribute as explanatory factors of the recorded patterns. Although habitat type is not a statistically significant explanatory variable of the genetic diversity patterns, the PhyloChip (G3) can identify groups of bacteria classified according to the habitat type. The phylogenetic analysis of the studied soil microbes revealed their distribution in several clades and valuable phylogenetic information obtained by the PhyloChip (G3).Conclusions Based on the results of the thesis we can conclude among others the following: a) the pattern of AOA dominance in soil of natural ecosystems is a broader trend in the dry areas of Mediterranean Basin, b)several soil factors drive the predominance of AOA, c) despite the limited number of available studies in Mediterranean area, it can be hypothesized that the AOA/AOB values in pastoral landscapes of the Mediterranean Basin compared with the ratio values of other biomes or ecosystems fluctuate at lower levels, d) altitude has both a direct and indirect role in the formation of the studied soil microbes genetic diversity patterns, e) the phylogenetic information retrieved by the use of PhyloChip (G3) has limited contribution in the retrieval of functional and ecological information and f) the selected microarrays could also potentially be used as a tool for monitoring soil microbes in the area at the level of phylum.

Πλαίσιο Οι εδαφικοί μικροοργανισμοί αποτελούν βασικούς συντελεστές των χερσαίων οικοσυστημάτων στην αποικοδόμηση της οργανικής ύλης και στην ανακύκλωση των θρεπτικών, με κεντρικό ρόλο στους βιογεωχημικούς κύκλους, όπως ο κύκλος του αζώτου. Παρ’ όλο που έχουν γίνει αρκετές μελέτες όσον αφορά τους περιβαλλοντικούς παράγοντες που διαμορφώνουν τη διανομή τους, υπάρχει ένα έλλειμμα γνώσης που αποτελεί και τον κύριο περιοριστικό παράγοντα για την ενσωμάτωση των εδαφικών μικροοργανισμών στις διαχειριστικές πρακτικές των εδαφών κυρίως σε μη καλλιεργούμενα εδάφη.Στόχοι Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν να συνεισφέρει, εξετάζοντας συγκεκριμένους τύπους χερσαίων ενδιαιτημάτων της Μεσογείου, α) στη μελέτη της σχετικής αφθονίας των νιτροδοποιητικών οργανισμών (ΑΟΑ, ΑΟΒ), β) στη μελέτη της γενετικής ποικιλότητας των νιτροδωποιητικών εδαφικών μικροοργανισμών (ΑΟΑ, ΑΟΒ) και των παραγόντων που συμβάλλουν στη διαμόρφωση των χωρικών προτύπων της, γ) στη μελέτη της γενετικής ποικιλότητας γενικότερα των βακτηριακών κοινοτήτων και των παραγόντων που συμβάλλουν στη διαμόρφωση των χωρικών προτύπων της, δ) στη μελέτη των δυνατοτήτων που μπορεί να έχει η χρήση μικροσυστοιχιών τρίτης γενιάς στην αναγνώριση ομάδων των μικροβιακών κοινοτήτων και ε) στη φυλογενετική ανάλυση των εδαφικών μικροοργανισμών τους.Μεθοδολογία Η συλλογή εδαφικών δειγμάτων έγινε από περιοχές που αντιπροσωπεύονται τύποι ενδιαιτημάτων του σχήματος NATURA2000. Από τις εδαφολογικές αναλύσεις και από επίγειες μετρήσεις συλλέχθηκαν εδαφολογικά δεδομένα και δεδομένα βλάστησης. Οι μοριακοί δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα γονίδια που κωδικοποιούν για το ενεργό κέντρο της αμμωνιακής μονοοξυγενάσης νιτροδωποιητικών βακτηρίων και αρχαίων (amoA genes), καθώς και το γονίδιο που κωδικοποιεί για την μικρή υπομονάδα του ριβοσώματος βακτηρίων και αρχαίων (16S rRNA). Η τεχνική που χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη της γενετικής ποικιλότητας βακτηρίων και αρχαίων ήταν η ανάλυση πολυμορφισμών μήκους ακραίων τμημάτων περιορισμού (TRFLP). Η PCR πραγματικού χρόνου (Real-Time PCR) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των μικροοργανισμών στα περιβαλλοντικά δείγματα. Η κατασκευή βιβλιοθηκών κλώνων έγινε κατά Sager και η μικροσυστοιχία που επελέγη ήταν η σειρά PhyloChip τρίτης γενιάς (G3) της εταιρίας Affymetrix. Αποτελέσματα Όπου κατέστη δυνατή η ανίχνευση των ΑΟΑ βάσει του amoA γονιδίου, τα ΑΟΑ φάνηκε να υπερτερούν αριθμητικά έναντι των ΑΟΒ σε αντίγραφα γονιδίου ανά gr ξηρού εδάφους. Ο λογάριθμος του λόγου ΑΟΑ/ΑΟΒ φάνηκε ότι συσχετίζεται θετικά με το εδαφικό pH. Η γενετική ποικιλότητα των νιτροδωποιητικών οργανισμών ΑΟΑ και ΑΟΒ βάσει του amoA γονιδίου φάνηκε ότι δεν μπορεί να ερμηνευτεί με βάση τον τύπο του ενδιαιτήματος κατά NATURA2000, αλλά ως ένα βαθμό μπορεί να ερμηνευτεί με στατιστικά σημαντικό τρόπο από κάποιες οικογένειες ξυλωδών ειδών. Η γενετική ποικιλότητα των βακτηριακών εδαφικών κοινοτήτων βάσει του 16S rRNA γονιδίου δεν διαφοροποιείται με βάση τον τύπο του ενδιαιτήματος κατά NATURA2000, ούτε οι εδαφολογικές παράμετροι φαίνεται να έχουν στατιστικά σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση, αλλά ακολουθείται ένα άλλο πρότυπο στο οποίο φαίνεται ότι συμμετέχει το υψόμετρο με κάποιες οικογένειες ξυλωδών ειδών. Παρ’ όλο που ο τύπος ενδιαιτήματος δεν μπορεί να ερμηνεύσει τη μεταβλητότητα των εδαφικών βακτηρίων στις περιοχές μελέτης, η χρήση του PhyloChip G3 μπορεί να εντοπίσει βακτηριακές ομάδες που ομαδοποιούνται με βάση τον τύπο του ενδιαιτήματος. Το ίδιο φαίνεται να ισχύει και για το PhyloChip G3 όσον αφορά τα αρχαία, στα οποία όμως, σε αντίθεση με το PhyloChip G3 για βακτηριακές κοινότητες, αδυνατεί να εντοπίσει ομάδες αρχαίων που ομαδοποιούνται με βάση τον τύπο του ενδιαιτήματος. Η φυλογενετική ταξινόμηση των νιτροδωποιητικών οργανισμών (ΑΟΑ, ΑΟΒ) της περιοχής μελέτης ανέδειξε ότι αυτά ομαδοποιούνται σε λίγους κλάδους, ενώ η φυλογενετική ανάλυση γενικά των βακτηριακών κοινοτήτων δείχνει ότι η δομή τους εμφανίζει χαρακτηριστικά που είναι διασκορπισμένα μεταξύ πολλών φυλογενετικών ομάδων. Από τα βακτήρια και τα αρχαία που εντοπίστηκαν από τη χρήση του PhyloChip G3 ταυτοποιήθηκαν σε επίπεδο φύλου σημαντικές ομάδες μικροοργανισμών που υπάρχουν στις περιοχές που μελετήθηκαν.Συμπεράσματα Με βάση τα αποτελέσματα μεταξύ άλλων μπορούμε να συμπεράνουμε: α) ότι υποστηρίζεται η υπόθεση κυριαρχίας των ΑΟΑ έναντι των ΑΟΒ στα χερσαία οικοσυστήματα της Μεσογείου, παρ’ όλο που τα διαθέσιμα δεδομένα διεθνώς δεν είναι ακόμη αρκετά, β) ότι πιθανότατα η έκβαση που οδηγεί στην κυριαρχία των ΑΟΑ προκύπτει από μηχανισμούς που ελέγχονται από διαφορετικές εδαφολογικές παραμέτρους, γ) ότι οι τιμές του λόγου ΑΟΑ/ΑΟΒ στα μη καλλιεργούμενα χερσαία οικοσυστήματα της Μεσογείου σε σύγκριση με τις τιμές του λόγου άλλων μεγακοινοτήτων (biomes) κυμαίνονται σε χαμηλότερα επίπεδα, δ)ότι η σχέση μεταξύ οικογενειών ξυλωδών φυτικών ειδών και γενετικής ποικιλότητας εδαφικών νιτροδωποιητικών οργανισμών αλλά και γενικότερα των βακτηριακών εδαφικών κοινοτήτων πιθανότατα διαφοροποιείται με το υψόμετρο, ε) ότι η λεπτομερής άντληση φυλογενετικών πληροφοριών, που επιτυγχάνεται με τις συγκεκριμένες μικροσυστοιχίες, είναι εις βάρος της άντλησης λειτουργικών οικολογικών πληροφοριών και στ) ότι οι συγκεκριμένες μικροσυστοιχίες είναι κατάλληλες και για παρακολούθηση μεταβολών των εδαφικών μικροβιακών κοινοτήτων σε επίπεδο φύλου ανεξαρτήτως τύπου ενδιαιτήματος.