Η μελέτη των μορίων αγγειογένεσης και επιδιόρθωσης του DNA σε ασθενείς με μονοκλωνική γαμμαπάθεια αδιευκρίνιστης σημασίας (MGUS) και ασυμπτωματικό πολλαπλούν μυέλωμα

Abstract

Regarding the role of key components of angiogenesis, the angiogenic cytokines in evolution of MM has not been fully investigated. Overall the relevant studies suggest that induction of angiogenesis is a feature of, and possible important in the transformation of MGUS to MM, and in the progression of early stage myeloma to advanced, refractory disease. It is crucial not only to identify which of these factors is important to angiogenesis of MM, but also to make available a useful tool of early prediction of symptomatic disease, that requires treatment. We therefore, measured the concentration of 4 factors that have a well-established angiogenic potential such as VEGF, ANG, ang-1 and -2. In our study, compared to healthy controls and patients with pre-cursor stages of MGUS and SMM, the myeloma patients presented increased levels of ang-2 in serum. In addition, the ratio of ang-1/ang-2 was found reduced in symptomatic patients in compared to health individuals and the 2 other groups of patients. According to our previous study, the reduced ratio of ang-1/ang-2 has been correlated with advanced disease features and poor survival of MM patients who received antimyeloma novel agents 16. Although that is already known that ang-2 is the natural antagonist of ang-1, and blocks ang-1 mediated Tie2 activation on endothelial cells and induces vessel destabilization, it still remains unclear the source of ang-2. As it has been previously demonstrated that myeloma cells lack expression of ang-2 mRNA and protein probably the increased levels of ang-2, according our data could be attributed to endothelial vascular cells production , as ang-2 facilitates endothelial production in response to VEGF that induce angiogenesis, constituting a vicious cycle.VEGF was also found increased in patients with MM and in all pre-malignant stages, indicating the angiogenic background of the disease. The absence of statistical significance between the healthy controls and the patients with MGUS, could be explained by the occurrence of angiogenic switch in stage of SMM and not earlier. The angiogenic switch is the loss of balance between the pro- and anti-angiogenic stimuli. In addition, the expected increase of tumor burden from stage of MGUS to symptomatic MM, could be responsible for these high levels of VEGF, as CD138+ myeloma cells express VEGF mRNA in almost all patients (80-90%) and high levels of this factor are also found in BM samples of them.Briefly, in these studies chromatin condensation, transcription activity and DNA damage response pathways (melphalan-induced DNA damage repair in four genomic loci including beta-actin, p53, N-ras and delta-globin genes, inhibition of RNA synthesis, accumulation of p53 protein and induction of apoptosis) were measured in PBMCs and plasma cells from patients with MGUS, SMM and MM (Responders and Non Responders to melphalan therapy). In agreement with previous studies, we found that beta-actin, p53 and N-ras genes were transcriptionally active while delta-globin gene was silent in all samples from healthy volunteers and MGUS patients. However, an induction of the transcription activity of delta-globin gene was found in ~45% of SMM and ~80% of symptomatic MM patients. Also, in both PBMCs and plasma cells the local looseness of the chromatin structure and the repair efficiency varied in the order: MGUS<SMM<MM-Responders<MM-Non-Responders. Also, since melphalan adducts can act as blocks for the elongation of RNA polymerases, we found that the intensity and the duration of both total RNA and mRNA synthesis varied in the order: Normal cells>MGUS>SMM>MM-Responders>MM-Non Responders. Moreover, in both PBMCs and plasma cells, the accumulation of p53 and the induction of apoptosis were suppressed during cancer progression, i.e. from MGUS to SMM and then to MM. Interestingly, a further suppression of both the accumulation of p53 and the induction of apoptosis was obtained as we go from MM-Responders to MM-Non Responders to melphalan therapy. These results suggest that myelomagenesis is associated with epigenetic changes and DNA damage response pathways alterations that can be used as novel molecular biomarkers for early diagnosis of the disease and prediction of clinical outcome.

Ο ρόλος των σημαντικών συστατικών της αγγειογένεσης, των αγγειοκινών στην εξέλιξη του ΠΜ δεν έχει πλήρως ερευνηθεί. Γενικότερα, όλες οι σχετικές μελέτες συνιστούν την αγγειογένεση ως ένα χαρακτηριστικό, και πιθανώς σημαντικό του μετασχηματισμού της MGUS στο ΠΜ, και στην πρόοδο του ΠΜ πρώιμου σταδίου σε προχωρημένη, ανθεκτική νόσο. Είναι ιδιαιτέρως σημαντικό όχι μόνο η ταυτοποίηση των σημαντικών παραγόντων της αγγειογένεσης του ΠΜ, αλλά και η χρησιμοποίηση αυτών ως ένα χρήσιμο εργαλείο πρόβλεψης της εξέλιξης της συμπτωματικής νόσου, που απαιτεί θεραπεία. Γι’ αυτό εξετάσαμε την συγκέντρωση 4 παραγόντων, με γνωστή αγγειογενετική δράση, τους VEGF, ANG, ang-1 και -2. Στη μελέτη μας, συγκρινόμενοι με τους υγιείς δότες, τους ασθενείς στα προ- στάδια της MGUS και του SMM, οι συμπτωματικοί ασθενείς με ΠΜ παρουσίαζαν αυξημένα επίπεδα ang-2 στον ορό. Επιπροσθέτως, ο λόγος των αγγειοποιητινών ang-1/ang-2 βρέθηκε μειωμένος στους συμπτωματικούς ασθενείς συγκρινόμενος με τους υγιείς δότες και τις άλλες δύο ομάδες υπό μελέτη ασθενών. Σε προηγούμενη μελέτη μας ο λόγος αυτός συσχετίστηκε με αρνητικά προγνωστικά χαρακτηριστικά της νόσου και πτωχή πρόγνωση των ασθενών, που έλαβαν στα πλαίσια της αντι-μυελωματικής τους θεραπείας νεότερους παράγοντες. Παρότι είναι ήδη γνωστό ότι η ang-2 είναι ο φυσικός ανταγωνιστής της ang-1, και αναστέλλει την ενεργοποίηση της ang-1, που διαμεσολαβείται από τον Tie-2 στα ενδοθηλιακά κύτταρα, και επάγει την αποσταθεροποίηση των αγγείων, παραμένει άγνωστη η πηγή προέλευσης της. Όπως έχει παλαιότερα καταδειχθεί τα μυελωματικά κύτταρα στερούνται έκφρασης του mRNA της ang-2 και πρωτεΐνης, και πιθανώς τα αυξημένα επίπεδα των δικών μας αποτελεσμάτων, να αποδίδονται στην παραγωγή από τα ενθοθηλιακά κύτταρα των αγγείων, καθόσον η ang-2 προωθεί την ενθοθηλιακή παραγωγή της σε απάντηση στον παράγοντα VEGF, που επάγει την αγγειογένεση, συγκροτώντας έναν φαύλο κύκλο. Ο VEGF βρέθηκε αυξημένος σε ασθενείς με ΠΜ και σε όλα τα προ- κακοήθη στάδια, αναδεικνύοντας το αγγειογενετικό υπόβαθρο της νόσου. Η απουσία στατιστικής σημαντικότητας μεταξύ των υγιών μαρτύρων και των ασθενών με MGUS, θα μπορούσε να εξηγηθεί στα πλαίσια μια αγγειογενετικής αλλαγής στο στάδιο του SMM και όχι νωρίτερα. Αυτή η αγγειογενετική αλλαγή συνίσταται στην απώλεια της ισορροπίας μεταξύ προ- και αντι- αγγειογενετικών σημάτων. Επιπροσθέτως, η αναμενόμενη αύξηση του φορτίου της νόσου από το στάδιο της MGUS στο συμπτωματικό ΠΜ, θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για τα υψηλά επίπεδα του παράγοντα, καθόσον τα CD138+ μυελωματικά κύτταρα εκφράζουν mRNA VEGF στην πλειοψηφία των ασθενών (80-90%) και υψηλά επίπεδα του παράγοντα βρίσκονται και σε δείγματα μυελού των οστών αυτών. Εν συντομεία, στη μελέτη μας η συμπύκνωση της χρωματίνης, η μεταγραφική ενεργότητα και τα μονοπάτια της διαδικασίας βλάβης του DNA και απόκρισης ( επαγόμενη από μελφαλάνη βλάβη του DNA και επιδιόρθωση σε τέσσερις γενετικούς τόπους, συμπεριλαμβανομένου της β-ακτίνης, p53, Νras και δ-γλοβίνης, της αναστολής της RNA σύνθεσης, άθροιση της p53, και η επαγωγή της απόπτωσης) εκτιμήθηκαν σε PBMCs και πλασματοκύτταρα από ασθενείς με MGUS, SMM και συμπτωματικό ΠΜ ( ανταποκριθέντες και μη σε χορηγηθείσα θεραπεία με μελφαλάνη). Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, παρατηρήσαμε ότι τα γονίδια της β-ακτίνης, του p53 και του N-ras ήταν μεταγραφικά ενεργά καθόσον το γονίδιο της δ-γλοβίνης ήταν σιωπηρό σ’ όλα τα δείγματα υγιών μαρτύρων και ασθενών με MGUS. Επίσης, η μεταγραφική ενεργότητα του γονιδίου της δ-γλοβίνης βρέθηκε σε περίπου 45% των ασθενών με SMM, και περίπου σε 80% των συμπτωματικών ασθενών με ΠΜ. Ακόμη, σε PBMCs και πλασματοκύτταρα η χαλαρότητα κατά τόπους της δομής της χρωματίνης και η επάρκεια της επιρθωτικής ικανότητας διαφοροποιείται ακολούθως: MGUS<SMM<ΜΜ-ανταποκριθέντες< ΜΜ – μη ανταποκριθέντες. Επιπροσθέτως, καθόσον οι βλάβες που προκαλεί η μελφαλάνη μπλοκάρουν την δράση των RNA πολυμερασών, βρήκαμε ότι η ένταση και η διάρκεια της συνολικής RNA και m RNA σύνθεσης διαφοροποιείται ακολούθως: φυσιολογικά κύτταρα> MGUS > SMM > ΠΜ-ανταποκριθέντες > ΠΜ- μη ανταποκριθέντες. Ακόμη, και στους δύο πληθυσμούς των κυττάρων, PBMCs και πλασματοκύτταρα, η συσσώρευση της p53 και η επαγωγή της απόπτωσης καταστέλλονται κατά την καρκινογένεση, δηλαδή από την MGUS στο SMM και κατόπιν στο ΠΜ. Ενδιαφέρον εύρημα αποτελεί η περαιτέρω καταστολή της συσσώρευσης της p53 και της επαγωγής της απόπτωσης, που παρατηρείται μελετώντας διαδοχικά τους ανταποκριθέντες ασθενείς με ΠΜ και τους μη-ανταποκριθέντες ασθενείς με ΠΜ στη θεραπεία με μελφαλάνη. Αυτά τα αποτελέσματα συνιστούν ότι η μυελωμαγένεση σχετίζεται με επιγενετικές αλλαγές και τροποποιήσεις των μονοπατιών της βλάβης του DNA και της κυτταρικής απόκρισης, οι οποίες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως νέοι μοριακοί βιοδείκτες της πρόωρης διάγνωσης της νόσου και της συνολικής απόκρισης ανταποκριθέντες. Επιπροσθέτως, καθόσον οι βλάβες που προκαλεί η μελφαλάνη μπλοκάρουν την δράση των RNA πολυμερασών, βρήκαμε ότι η ένταση και η διάρκεια της συνολικής RNA και m RNA σύνθεσης διαφοροποιείται ακολούθως: φυσιολογικά κύτταρα> MGUS > SMM > ΠΜ-ανταποκριθέντες > ΠΜ- μη ανταποκριθέντες. Ακόμη, και στους δύο πληθυσμούς των κυττάρων, PBMCs και πλασματοκύτταρα, η συσσώρευση της p53 και η επαγωγή της απόπτωσης καταστέλλονται κατά την καρκινογένεση, δηλαδή από την MGUS στο SMM και κατόπιν στο ΠΜ. Ενδιαφέρον εύρημα αποτελεί η περαιτέρω καταστολή της συσσώρευσης της p53 και της επαγωγής της απόπτωσης, που παρατηρείται μελετώντας διαδοχικά τους ανταποκριθέντες ασθενείς με ΠΜ και τους μη-ανταποκριθέντες ασθενείς με ΠΜ στη θεραπεία με μελφαλάνη. Αυτά τα αποτελέσματα συνιστούν ότι η μυελωμαγένεση σχετίζεται με επιγενετικές αλλαγές και τροποποιήσεις των μονοπατιών της βλάβης του DNA και της κυτταρικής απόκρισης, οι οποίες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως νέοι μοριακοί βιοδείκτες της πρόωρης διάγνωσης της νόσου και της συνολικής απόκρισης.