Μελέτη της ακετυλίωσης και της μεθυλίωσης στην αναδιοργάνωση της χρωματίνης κατά τη γήρανση

Abstract

The term epigenetic changes of chromatin is used to describe changes in the regulation of gene activity and expression, that are not dependent on gene sequence. The most studied epigenetic changes are histone post-translational modifications and DNA methylation. These studies have shown that epigenetic changes play an important role in a broad range of biological functions and also that their deregulation is involved in many disease states. Moreover, a large body of data has correlated epigenetic changes with the aging process. However, the mode by which these changes exert their effects on gene expression and their mechanisms of action still need further clarification. The first part of the present study was focused on the epigenetic changes of chromatin that occur in age-related genes. The first candidate was H1.0, a gene that encodes for a DNA linker histone variant that has been shown to be related to both in vivo and in vitro aging. In the present study, H1.0 mRNA levels were found to be elevated in both Go phase and PHA-activated lymphocytes of old donors as compared to young. These observations are in agreement with results for the levels of histone acetylation that were found to be higher in the old donor samples as compared to those of the young samples, for the entire H1.0 gene region and especially around the promoter region of the gene. Additionally, the same histone acetylation changes were also found in fibroblasts from young and old donors. Histone H3K4 trimethylation didn’t seem to have important age-related changes in lymphocytes, mainly because the differences observed didn’t correlate with the H1.0 mRNA levels. Lastly, neither H1.0 mRNA levels nor changes in histone modification levels (acetylation and H3K4me3) were found to occur as a function of age in the third aging cell system used in this study, i.e., monocytes and in vitro differentiated dendritic cells. The second gene that was analyzed was DFNA5, a gene whose expression levels were found to change during development from previous studies in mice. In the present thesis work, microarray and real time PCR analyses of monocytes and in vitro differentiated dendritic cells from donors of different age groups showed that this gene’s mRNA levels change, both as a function of differentiation of monocytes to dendritic cells, and as a function of age. More particularly, DFNA5 expression levels were found to be higher in dendritic cells as compared to monocytes. With respect to age, DFNA5 expression levels were higher in dendritic cells of newborns as compared 213 to the dendritic cells of adult donors. The study of histone post-translational modifications revealed that there are age-related epigenetic changes around the DFNA5 gene region, but different to those observed in the H1.0 gene. H3K4 trimethylation (Η3Κ4me3), a histone modification associated with active genes, was found to be higher in the dendritic cells derived from newborns as compared to those from adult donors. On the contrary, H3K27 trimethylation, an epigenetic mark of silenced genes, was higher in the adult samples. These observations concur with the age-related differences in the expression levels of DFNA5 . Both genes, H1.0 and DFNA5, were observed to have age-related chromatin epigenetic changes which are consistent with the changes found in their mRNA levels. However, the type of histone epigenetic change that occurred as a function of age differed amongst the two genes. In the case of H1.0, histone acetylation was found to be the major determinant in the gene’s expression levels, whereas histone methylation levels were central to the DFNA5 gene. If one takes into account that there are major structural differences between the two genes, then specific sequence characteristics may dictate specific types of epigenetic changes during aging. This may mean that there are specific DNA sequence structures more susceptible to agerelated epigenetic changes. In line with this latter hypothesis, we continued the present thesis work in the direction of finding specific DNA sequence characteristics and structures which may be more susceptible to chromatin epigenetic structural changes during aging. In order to carry out this line of work, a whole genome scale technique and a well-studied epigenetic mark were chosen. DNA methylation was chosen, since it is an epigenetic mark that has been well-studied during the past years and has also been linked to development and aging. Methylated DNA immunoprecipitation was performed, followed by analysis of the immunoprecipitated DNA with next generation sequencing (MeDIP-Seq). This technique allows one to study the methylome on a whole-genome scale without bias or focus on specific gene regions. The results presented in this thesis work were from 3 different experiments. In each experiment, comparisons were carried out between two age groups, newborns and adults, with pooled DNA samples (10 donors from each age-group), so as to avoid differences due to individual variation. In the first experiment DNA was pooled from monocytes of each age-group. In the second and third experiments, DNA was pooled 214 from both monocytes and dendritic cells, respectively, from 10 donors of each agegroup. Initially, macroscopic analysis of the first two experiments proved the credibility of the technique that was used, but didn’t reveal any wide-range age-related differences in the methylome. Next, the whole genome was scanned at a better resolution level (scanning window: 100kb, 2kb etc.). The results from this line of work showed that 349 regions appeared to have at least a 1.5 fold difference between newborns and adults. The main characteristic of these regions was that they were GC-rich and contained multiple small CpG islands (smaller than usually described) which we named CpG “micro-clusters”. Further analysis of the results revealed another sequence characteristic susceptible to age-related changes in methylation, regions rich in sequences that are at least partially repeated more than once in the genome (not classic repeat sequences) and are excluded by the repeat masker program (Multiple Aligned Repeat-Masker eXcluded sequences, MAReX). From the analysis of all three experiments, a number of genes contained, or were adjacent to, MAReX sequences and also had age-related differences. These genes were members of the PCDHG and FAM90A gene families and the HRNR and PROP1 genes. Finally, we analyzed genes with at least 2 fold age-related differences in DNA methylation that had all of the above characteristics. These genes were FZD1, FZD7, FGF17 and the pseudogene ECEL1P2. All of these genes appeared to be implicated in cell cycle-related events and early mammalian development. These sites were also enriched in H3K27 trimethylation at exactly the same positions as those where age-related DNA methylation differences were observed. However, in this case the age-related changes were in opposite directions. The conclusions drawn from the second part of this thesis work are that there are some structures in the genome more susceptible to age-related epigenetic changes. These structures seem to be regions rich in CpG “micro-clusters” and MAReX sequences.

Οι επιγενετικές αλλαγές της δομής της χρωματίνης επιδρούν στην ενεργότητα και την έκφραση γονιδίων, χωρίς να εμπλέκονται αλλαγές στην αλληλουχία του DNA. Οι πιο καλά μελετημένες επιγενετικές αλλαγές είναι οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών και η μεθυλίωση του DNA, οι οποίες έχει δειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο σε διάφορες βασικές βιολογικές διεργασίες καθώς επίσης ότι η απορρύθμιση τους εμπλέκεται σε διάφορες ασθένειες. Σημαντικός αριθμός βιβλιογραφικών δεδομένων συσχετίζει τις επιγενετικές αυτές αλλαγές με τη διαδικασία της γήρανσης (Calvanese et al., 2009; Bandyopadhyay και Medrano, 2003). Ωστόσο ο τρόπος με τον οποίο επιδρούν στη γονιδιακή έκφραση αλλά και ο μηχανισμός δράσης τους δεν είναι πλήρως γνωστά. Το πρώτο μέρος των πειραμάτων της παρούσας διατριβής σκοπό είχε την μελέτη επιγενετικών αλλαγών σε γονίδια τα οποία σχετίζονται με τη γήρανση ή των οποίων η έκφραση αλλάζει με την ηλικία. Καταρχήν μελετήθηκε το γονίδιο της Η1.0, μία ποικιλομορφία των ιστονών του συνδέτου DNA η οποία έχει συνδεθεί σύμφωνα με προηγούμενα βιβλιογραφικά δεδομένα τόσο με την in vivo όσο και με την in vitro γήρανση. Στην παρούσα διατριβή βρέθηκε πως τα επίπεδα έκφρασης του συγκεκριμένου γονιδίου είναι υψηλότερα σε ενεργοποιημένα και μη ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα από ηλικιωμένους δότες σε σχέση με αυτά από νεαρούς δότες. Το ίδιο παρατηρήθηκε και για την ακετυλίωση των ιστονών στην περιοχή του γονιδίου της Η1.0, με τα επίπεδα ακετυλίωσης να είναι υψηλότερα σε όλη την περιοχή του γονιδίου και ιδιαίτερα στη θέση του υποκινητή σε ενεργοποιημένα και μη ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα από ηλικιωμένους δότες σε σχέση με τους νεαρούς. Το ίδιο αποτέλεσμα προέκυψε και για ινοβλάστες από ηλικιωμένους και νεαρούς δότες. Αλλαγές που παρατηρήθηκαν στα επίπεδα μεθυλίωσης της ιστόνης Η3 (Η3Κ4me3) στο γονίδιο Η1.0 σε λεμφοκύτταρα, δεν σχετίζονταν με τα επίπεδα mRNA. Τέλος, τόσο η έκφραση της Η1.0 όσο και οι επιγενετικές αλλαγές στην περιοχή του γονιδίου αυτού δεν αλλάζουν σε σχέση με την ηλικία στο σύστημα μονοκυττάρων και in vitro διαφοροποιημένων δενδριτικών κυττάρων. Το δεύτερο γονίδιο το οποίο μελετήθηκε είναι το DFNA5 του οποίου η έκφραση αλλάζει με την ανάπτυξη, όπως προκύπτει από προηγούμενες μελέτες σε ποντικούς. Στην παρούσα διατριβή, οι αναλύσεις με μικροσυστοιχείες και PCR πραγματικού 208 χρόνου μονοκυττάρων και δενδριτικών κυττάρων από δότες διαφόρων ηλικιών, έδειξαν ότι το γονίδιο αυτό εμφανίζει διαφορές κατά την διαφοροποιήση από μονοκύτταρα προς δενδριτικά κύτταρα αλλά και σε συνάρτηση με την ηλικία Συγκεκριμένα, η έκφραση αυτού του γονιδίου είναι πολύ υψηλότερη στα δενδριτικά κύτταρα σε σχέση με αυτή των μονοκύτταρων. Σε συνάρτηση με την ηλικία, η έκφραση του DFNA5 είναι υψηλότερη στα δενδριτικά κύτταρα νεογέννητων σε σχέση με τα δενδριτικά κύτταρα από ενήλικες δότες. Από την μελέτη επιγενετικών αλλαγών προέκυψε ότι σε αντίθεση με το γονίδιο Η1.0, στην περιοχή του γονιδίου DFNA5 παρατηρήθηκαν αλλαγές στη μεθυλίωση των ιστονών σε σχέση με την ηλικία. Οι μεταβολές αυτές συμφωνούν με τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου. Η τριμεθυλίωση της Η3 (Η3Κ4me3), που συνδέεται με ενεργοποίηση της μεταγραφής, εμφανίζει υψηλότερα επίπεδα σε δενδριτικά κύτταρα από νεογέννητα σε σχέση με αυτά των δενδριτικών κυττάρων από ενήλικες δότες. Εξ άλλου, η τριμεθυλίωση της Η3 (Η3Κ27me3) που συνδέεται με αποσιώπηση της μεταγραφής εμφανίζει υψηλότερα επίπεδα, τόσο σε μονοκύτταρα όσο και σε δενδριτικά κύτταρα, από νεαρούς δότες σε σχέση με αυτά από νεογέννητα. Όπως φαίνεται τα δύο αυτά γονίδια μεταβάλλονται με την ηλικία και συγκεκριμένα μεταβάλλεται τόσο η έκφραση όσο και ορισμένες επιγενετικές αλλαγές αυτών. Ωστόσο οι επιγενετικές αλλαγές που λαμβάνουν χώρα με την ηλικία διαφέρουν μεταξύ των δύο αυτών γονιδίων, η ακετυλίωση των ιστονών επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου Η1.0, ενώ στην έκφραση του γονιδίου DFNA5 παίζει κύριο ρόλο η μεθυλίωση των ιστονών. Τα δύο αυτά γονίδια διαφέρουν αρκετά στη δομή τους και ίσως αυτό σημαίνει πως συγκεκριμένα χαρακτηριστικά της αλληλουχίας τους υπαγορεύουν συγκεκριμένες επιγενετικές αλλαγές με την ηλικία. Κατά συνέπεια ίσως συγκεκριμένες δομές του γενετικού υλικού εμφανίζονται πιο δεκτικές σε μεταβολές της χρωματίνης με την ηλικία. Με βάση αυτά τα δεδομένα προχωρήσαμε την έρευνα με σκοπό την εύρεση συγκεκριμένων δομών οι οποίες εμφανίζονται πιο ευαίσθητες σε αλλαγές της δομής της χρωματίνης κατά τη γήρανση. Για την εύρεση συγκεκριμένων δομών και χαρακτηριστικών της αλληλουχίας του DNA οι οποίες συνδέονται με αλλαγές της χρωματίνης με την ηλικία έπρεπε να διερευνηθεί ολόκληρο το γονιδίωμα και για να γίνει αυτό εφικτό έπρεπε να επιλεχθεί μία συγκεκριμένη επιγενετική αλλαγή. Επιλέχθηκε η μεθυλίωση του DNA η οποία είναι από τις πιο καλά μελετημένες επιγενετικές αλλαγές και με πολλά βιβλιογραφικά δεδομένα να τη συνδέουν με την ανάπτυξη και την γήρανση. Για την ανάλυση 209 χρησιμοποιήθηκε η ανοσοκατακρήμνιση μεθυλιωμένου DNA και ανάλυση της αλληλουχίας του προϊόντος της ανοσοκατακρήμνισης με τεχνολογία νέας γενιάς (MeDIP-SEQ), μία τεχνική που επιτρέπει την ανάλυση του μεθυλώματος χωρίς να στοχεύει σε συγκεκριμένες περιοχές. Πραγματοποιήθηκαν τρία διαφορετικά πειράματα όπου σε κάθε ένα συγκρίνονται δύο ηλικιακές ομάδες, νεογέννητα και ενήλικοι δότες. Κάθε ηλικιακή ομάδα προκύπτει από συνδυασμό DNA 10 ατόμων, ώστε να αποφευχθούν οι διακυμάνσεις λόγω ποικιλομορφίας μεταξύ ατόμων. Στο πρώτο πείραμα συνδυάστηκαν DNA από 10 δείγματα μονοκυττάρων από 10 δότες για κάθε ηλικιακή ομάδα. Το δεύτερο και τρίτο πείραμα προέκυψε από συνδυασμό του DNA μονοκυττάρων και δενδριτικών κυττάρων αντίστοιχα από 10 δότες για κάθε ηλικιακή ομάδα. Αρχικές μακροσκοπικές αναλύσεις των δύο πρώτων πειραμάτων έδειξαν πως δεν υπάρχουν μεγάλου εύρους αλλαγές του μεθυλώματος με την ηλικία, ωστόσο αποδείχθηκε η πιστότητα και η επιτυχία της τεχνικής που χρησιμοποιήθηκε. Στη συνέχεια ανάλυση των αποτελεσμάτων με σάρωση του γονιδιώματος εστιάζοντας κάθε φορά σε συγκεκριμένες περιοχές (παράθυρο σάρωσης: 100 κιλοβάσεις, 2 κιλοβάσεις κ.λ.π.) έδειξε 349 περιοχές με τουλάχιστον 1.5 φορές μεταβολή στη μεθυλίωση του DNA με την ηλικία. Χαρακτηριστικό της πλειοψηφίας των περιοχών αυτών είναι ότι είναι πλούσιες σε GC δινουκλεοτίδια και σε CpG μικρο-νησίδες, δηλαδή περιοχών με τα χαρακτηριστικά CpG νησίδας αλλά μικρότερες σε μέγεθος από νησίδες. Περαιτέρω ανάλυση έδειξε πως ένα άλλο χαρακτηριστικό των αλληλουχιών των περιοχών των οποίων η DNA μεθυλίωση αλλάζει με την ηλικία, είναι η παρουσία μικρότερων αλληλουχιών οι οποίες τουλάχιστον μερικώς πολυ- στοιχίζονται στο γονιδίωμα, αλλά δεν αποτελούν κλασικές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (MARΜeX). Στη συνέχεια από το συνδυασμό και των τριών πειραμάτων αναλύθηκαν λεπτομερώς συγκεκριμένα γονίδια τα οποία γειτνιάζουν με αυτές τις MARΜeX περιοχές. Αυτά είναι τα μέλη της οικογένειας PCDHG και FAM90A καθώς και τα γονίδια HRNR και PROP1. Εκτός από την ανάλυση για περιοχές με αλληλουχίες MAReX αναλύθηκαν και παραδείγματα γονιδίων που προέκυψαν από αναλύσεις για μονοαντιστοιχίσιμες αλληλουχίες, αλλά με μεταβολές στη μεθυλίωση του DNA τουλάχιστον δύο φορές μεταξύ των δύο ηλικιακών ομάδων. Συγκεκριμένα παραδείγματα αποτελούν τα γονίδια FZD1, FZD7, FGF17 και το ψευδογονίδιο ECEL1P2 τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο σε κυτταρικές διαδικασίες που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο και τη ανάπτυξη. Οι θέσεις αυτές των 210 παραπάνω γονιδίων παρουσιάζουν εμπλουτισμό και στην τριμεθυλίωση της ιστόνης Η3 (Η3Κ27me3) ακριβώς στα ίδια σημεία όπου εμφανίζονται μεταβολές στην DNA μεθυλίωση, αλλά αλλάζουν με αντίθετες ηλικιακές κατευθύνσεις. Το συμπέρασμα από τα πειράματα του δεύτερου μέρους είναι πως περιοχές πλούσιες σε GC δινουκλεοτίδια και CpG “μικρονησίδες”, καθώς και περιοχές που συνδυάζουν τα παραπάνω χαρακτηριστικά με μικρές πολυαντιστοιχίσιμες αλληλουχίες (MAReX), αποτελούν περιοχές που φαίνεται να είναι πιο δεκτικές και ευαίσθητες σε επιγενετικές αλλαγές με την ηλικία.