Μελέτη της νευρογένεσης κατά μήκος της οδοντωτής έλικας του ιπποκαμπείου σχηματισμού του ενήλικου εγκεφάλου

Abstract

It is nowadays unambiguously accepted that the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus (DG) and the subventricular zone of the lateral ventricles are two discrete regions of the mammalian brain that continue to give rise to new neurons throughout life. Neuronal precursor cells of the subgranular zone, after a complex proliferation and differentiation process, give rise to new immature granule cells that migrate radially to the granule cell layer, further maturing to functional granule cells that are undistinguished from older granule cells, being fully integrated into the local neuronal circuits.The DG of the mammalian brain exhibits structural, biochemical, genomic, electrophysiological and functional differentiations along its septo-temporal axis, predisposing for possible differentiations in the ongoing neurogenesis process between its septal and temporal part. The septal DG seems to be capable for generating an increased number of newborn neurons as compared to the temporal DG. Differentiations in maturation rate of the two distinct adult-born neuronal populations also arise, since the septally born neurons prove to reach earlier a mature neuronal phenotype. Electrophysiological studies further support this notion showing that increased levels of basal network activity in the septal part lead to a faster newborn neurons maturation and functional integration rate, implying that the ongoing genesis is highly activity-dependent. Thus, many aspects of the multi-staged neurogenesis process are thought to radically differ between the highly active septal DG and the less active temporal DG.The present study examined comparatively the proliferation, differentiation, migration and maturation of the newborn cells in the septal and temporal part of the DG. In order to label adult born neurons, experimental animals (twenty four 3-month old male Wistar rats) received two i.p. injections of 5-Bromo-2´-deoxyuridine (BrdU; 20mg/ml solution in saline at a dose of 100mg/kg/injection), 12hours apart. Animals were then transcardialy perfused at different days post BrdU injection (dpi: 2, 5, 7, 14, 21 and 30). Paraffin embedded 10μm thick coronal sections, along the entire septal DG (-2,56 to -4,16 mm relative to Bregma, according to atlas of Paxinos and Watson, 1998) and temporal DG (-4,80 to -6,04 mm) were systematically selected for either Nissl staining, single BrdU immunolabeling or double immunofluorescence for BrdU and selected markers.One in twenty sections (200 μm apart) were Nissl stained and the optical disector method was applied so as to estimate the total absolute number of granule cells per septal and temporal DG. Newly born cells of the septal and temporal DG were detected using immunohistochemistry against the antigen of BrdU. Single DAB immunohistochemistry was performed in one in ten sections (100 μm apart) from both septal and temporal DG so as to count the absolute number of BrdU+ cells. Counted number was then multiplied ten times in order to calculate the total absolute number of BrdU+ newborn cells per DG.In selected equidistant sections from both DG parts, double immunofluorescence for BrdU and specific markers (GFAP, DCX, NeuN, calretinin, calbindin or S100) permitted identification and quantification of the sub-populations found in successive time-frames of adult neurogenesis and/ or gliogenesis process. Newborn neurons’ synaptic formation was confirmed through expression of the glutamate receptors NMDA (subunit R1) and AMPA (subunit GluR2). Their migration from the SGZ to the inner GCL was also followed. Apoptosis of newborn cells was evaluated by means of caspase-3 and fractin expression. At least 50 and 30 BrdU+ cells per septal and temporal DG ,respectively, were examined under a confocal lazer scanning microscope (CLSM; Nikon Eclipse C1; EZ - C1 3.20 software) for co-expression with each marker of interest.Statistical analysis was performed using the SPSS 20.0 statistical software. One-way ANOVA (Bonferroni post hoc analysis) and independent samples T-test were used for comparisons between groups. When assumptions for parametric analysis were violated, the non-parametric Kruskal-Wallis (two-tailed) was assessed for multiple comparisons, followed by the Mann-Whitney U test (two-tailed) for group-by-group comparisons. All results are expressed as mean ± S.E. Significance was set at P< 0.05. For the study of BrdU+ cells distribution curve fit analysis was performed and ANOVA table was displayed.BrdU immunocytochemistry revealed comparatively higher numbers of BrdU+ cells in the septal part, but stereological analysis of newborn and total granule cells showed an identical ratio in the two parts, indicating an equivalent neurogenic ability. Similar cell producing ability of the septal and temporal DG is accompanied by similar distribution pattern of newborn cells along each part's longitudinal and transverse axis.However, despite the initially equal potential and ability for new cells genesis, the division rate and pattern of the septal and temporal proliferating cells diverged in the two parts over time. Dynamic differences in the differentiation, migration and maturation process of the two BrdU-incorporating subpopulations of newborn neurons were also detected. Newborn neurons of the septal DG showed a prolonged DCX expression and migration rate, but expressed earlier mature neuronal markers and succeeded synaptogenesis. Significant differences in the survival pattern of the septal and temporal DG newborn neurons also arised. Similarly, at both parts, extremely low levels of newborn glial and apoptotic cells were detected.Ratios of newborn to total granule cells were homogeneous along the transverse axis as well. Although infra-pyramidal and supra-pyramidal blades were presented with equal neurogenic ability all along the septo-temporal axis, significant differences in the survival of newborn neurons arised, since the supra-pyramidal blade was capable of increased survival rates.Observed variations in neurogenesis parameters between the initially similar progressing process, suggests that local microenvironment and its attributed function may differently orchestrate the ongoing process in the septal and temporal DG part. Moreover, amazing similarities in neurogenesis parameters between certain DG sub-regions (septal DG and infra-pyramidal blade as opposed to temporal DG and supra-pyramidal blade, respectively), highlight the role of developmental age as the key factor that a priori defines each region’s capacity for viability and integration of adult-born neurons.Therefore, we propose that various factors, including developmental date birth, local DG microenvironment and distinct function of the two parts may be the critical regulators of the ongoing neurogenesis process, leading the septal part to a continuous, rapid and less disciplined genesis rate, whereas the quiescent temporal microenvironment preserves a quite steady, less demanding neurogenesis process.

Δύο περιοχές του ενήλικου εγκεφάλου, η υποκοκκώδης ζώνη της οδοντωτής έλικας του ιπποκάμπειου σχηματισμού και η υποκοιλιακή ζώνη των πλάγιων κοιλιών, διατηρούν την ικανότητα να παράγουν νέα νευρικά κύτταρα καθ’ όλη τη διάρκεια της ενήλικης ζωής. Τα πρόδρομα νευρικά κύτταρα της υποκοκκώδους ζώνης, ακολουθώντας μία σύνθετη διαδικασία πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης, παράγουν νέα κοκκοειδή κύτταρα τα οποία μεταναστεύουν στην κοκκώδη στιβάδα και ενσωματώνονται πλήρως στα υπάρχοντα νευρωνικά κυκλώματα.Η δομική, βιοχημική, γονιδιακή, ηλεκτροφυσιολογική και λειτουργική διαμερισματοποίηση της οδοντωτής έλικας κατά το διαμήκη (ή διαφραγματο-κροταφικό) άξονά της επηρεάζει σημαντικά τη συνεχή διαδικασία παραγωγής των νέων νευρικών κυττάρων. Στο διαφραγματικό τμήμα της οδοντωτής έλικας ανιχνεύεται σημαντικά μεγαλύτερος αριθμός νεοπαραγόμενων νευρικών κυττάρων συγκριτικά με το κροταφικό της τμήμα, ενώ παράλληλα αποδεικνύονται και σημαντικές διαφορές στο ρυθμό ωρίμανσης των νεοπαραγόμενων νευρώνων. Ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες αποδίδουν την ταχύτερη ωρίμανση των νέων νευρώνων του διαφραγματικού τμήματος στα αυξημένα επίπεδα της τοπικής βασικής ηλεκτρικής δραστηριότητας, εικάζοντας ότι το εξαρτώμενο από τη δραστηριότητα φαινόμενο της νευρογένεσης πιθανώς να παρουσιάζει και άλλες διαφορές μεταξύ του δραστήριου διαφραγματικού τμήματος και του λιγότερο ενεργού κροταφικού τμήματος.Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε συγκριτικά ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η μετανάστευση και η ωρίμανση των νέων κυττάρων της οδοντωτής έλικας στο διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα της. Για τη σήμανση των νεοπαραγόμενων κυττάρων της οδοντωτής έλικας, χορηγήθηκαν στους επίμυες (εικοσιτέσσερεις αρσενικοί επίμυες ηλικίας τριών μηνών κατά την έναρξη των πειραματισμών) δύο ενδοπεριτοναϊκές εγχύσεις του διαλύματος της 5-βρωμο-2΄-δεοξυουριδίνης (BrdU, 20mg/ml σε φυσιολογικό ορό 0,9%) στη δόση των 100mg/Kg/έγχυση, με μεσοδιάστημα δώδεκα ωρών. Ακολούθως, οι επίμυες θυσιάστηκαν υπό γενική αναισθησία με ενδοκαρδιακή χορήγηση διαλύματος φυσιολογικού ορού ακολουθούμενο από μονιμοποιητικό διάλυμα 4% παραφορμαλδεϋδης, σε προκαθορισμένες χρονικές στιγμές μετά την έγχυση της BrdU (2, 5, 7, 14, 21 και 30 ημέρες).Από τους μονιμοποιημένους εγκεφάλους λήφθηκαν στεφανιαίες τομές παραφίνης πάχους 10μm, καθ’ όλο το μήκος του διαφραγματικού (-2,56 έως -4,16 mm αναφορικά με το βρέγμα, σύμφωνα με τον άτλαντα των Paxinos και Watson, 1998) και του κροταφικού τμήματος (-4,80 έως -6,04 mm) της οδοντωτής έλικας. Οι τομές που επιλέχθηκαν σημάνθηκαν είτε με τη χρώση Nissl είτε με απλή ανοσοϊστοχημεία έναντι του αντιγόνου της BrdU, ώστε να είναι εφικτή η καταμέτρηση του συνολικού πληθυσμού των κοκκοειδών κυττάρων και των νεοπαραγόμενων κυττάρων, αντίστοιχα, στα δύο τμήματα της οδοντωτής έλικας.Σε επιλεγμένες τομές καθ’ όλο το μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα της οδοντωτής έλικας εφαρμόστηκε διπλή ανοσοϊστοχημεία φθορισμού έναντι της BrdU και επιλεγμένων αντιγονικών δεικτών που εκφράζονται κατά τα διαδοχικά στάδια ανάπτυξης των νέων νευρώνων. Οι δείκτες αυτοί ήταν η όξινη πρωτεΐνη των ινιδίων της αστρογλοίας (GFAP), η διπλοκορτίνη (DCX), η πυρηνική πρωτεΐνη των νευρώνων (NeuN), η καλρετινίνη και η καλβινδίνη. Η πρωτεΐνη S100, ειδική των ώριμων αστροκυττάρων, χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης της παράλληλης αστρογλοιογένεσης στην οδοντωτή έλικα. Η δημιουργία των γλουταμινεργικών συνάψεων από τους νεοπαραγόμενους νευρώνες επιβεβαιώθηκε μέσω των αντιγόνων της υπομονάδας R1 των NMDA υποδοχέων και της υπομονάδας GluR2 των AMPA υποδοχέων, ενώ μελετήθηκε και η σταδιακή μετανάστευσή τους από την υποκοκκώδη ζώνη στην κοκκώδη στιβάδα. Η απόπτωση μερίδας του πληθυσμού των νέων νευρώνων μελετήθηκε μέσω της έκφρασης των αντιγόνων της κασπάσης-3 και της φρακτίνης. Τουλάχιστον 50 και 30 BrdU+ κύτταρα του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος αντίστοιχα, μελετήθηκαν με τη βοήθεια του συνεστιακού μικροσκοπίου (Nikon Eclipse C1, λογισμικό EZ - C1 3.20) για πιθανή συνέκφραση με κάθε δείκτη.Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με το στατιστικό πακέτο SPSS 20.0. Η ανάλυση διακύμανσης κατά έναν παράγοντα (one-way ANOVA) και το T–test ανεξάρτητων δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν για τις συγκρίσεις μεταξύ των πειραματικών ομάδων. Η ομοιογένεια των διακυμάνσεων ελεγχόταν με το τεστ του Levene, και όταν αυτή παραβιαζόταν (Levene’s test, P< 0.05), εφαρμοζόταν ο μη παραμετρικός έλεγχος του Kruskal-Wallis για τις πολλαπλές συγκρίσεις, ακολουθούμενος από τον έλεγχο του Mann-Whitney (two-tailed) για τις επιμέρους συγκρίσεις. Όλα τα ποσοτικά αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα (mean ± S.E.) και για όλες τις συγκρίσεις το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο 5% (P< 0.05). Προκειμένου για τη μελέτη της τοπογραφικής κατανομής των BrdU+ κυττάρων πραγματοποιήθηκε η ανάλυση προσαρμογής της καμπύλης (curve fit analysis), ακολουθούμενη από την ανάλυση της διακύμανσης κατά έναν παράγοντα.Η ανοσοϊστοχημεία έναντι της BrdU αποκάλυψε ότι μεγαλύτερος πληθυσμός BrdU+ κυττάρων εποικίζει το διαφραγματικό τμήμα της οδοντωτής έλικας, αλλά η παράλληλη στερεολογική ανάλυση των πληθυσμών των νεοπαραγόμενων και των κοκκοειδών κυττάρων απέδειξε ότι τα δύο τμήματα της οδοντωτής έλικας διαθέτουν ισοδύναμη ικανότητα για παραγωγή νέων νευρικών κυττάρων. Παράλληλα, όμοιο εμφανίζεται και το πρότυπο κατανομής των νέων νευρικών κυττάρων κατά το διαμήκη και τον εγκάρσιο άξονα των δύο τμημάτων.Παρά τον αρχικά όμοιο ρυθμό πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των διαιρούμενων κυττάρων καθ’ όλο το μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα, οι δύο πληθυσμοί των νεοπαραγόμενων νευρώνων συμπεριφέρονται διαφορετικά κατά την εξέλιξη της διαφοροποίησης, μετανάστευσης και ωρίμανσης τους. Οι νέοι νευρώνες του διαφραγματικού τμήματος παρουσιάζουν αυξημένη ικανότητα πολλαπλασιασμού και παρατεταμένη μετανάστευση, επιτυγχάνουν όμως ταχύτερη έκφραση ώριμων νευρωνικών δεικτών και συναπτογένεση. Σημαντικές διαφορές εντοπίζονται και στην επιβίωση των νεοπαραγόμενων νευρώνων του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος, ενώ αντίθετα, όμοια και ιδιαιτέρως χαμηλά ανιχνεύονται τα ποσοστά αστρογλοιογένεσης και αποπτωτικών νεοπαραγόμενων νευρώνων στα δύο τμήματα της οδοντωτής έλικας.Η ισοδύναμη ικανότητα για παραγωγή νέων νευρικών κυττάρων επαληθεύεται και κατά μήκος του εγκάρσιου άξονα του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος της οδοντωτής έλικας. Αποκλίσεις όμως ανιχνεύονται στην επιβίωση των νέων νευρικών κυττάρων, με το υπερ-πυραμιδικό σκέλος να παρουσιάζει αυξημένα ποσοστά επιβίωσης των εκεί παραγόμενων νευρώνων.Οι σημαντικές διαφορές που ανακύπτουν στην αρχικά όμοια εξελισσόμενη νευρογένεση του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος, συσχετίζονται προφανώς άμεσα με τις υπάρχουσες διαφοροποιήσεις του τοπικού μικροπεριβάλλοντος και της ειδικότερης λειτουργίας αυτού. Παράλληλα, ενδιαφέρουσες είναι οι ομοιότητες που παρατηρούνται μεταξύ των μορφογενετικά ‘νεότερων’ περιοχών (διαφραγματικό τμήμα και υπο-πυραμιδικό σκέλος), καθώς και μεταξύ των μορφογενετικά ‘παλαιότερων’ περιοχών (κροταφικό τμήμα και υπερ-πυραμιδικό σκέλος) της οδοντωτής έλικας.Επομένως, οι γνωστές δομικές, ηλεκτροφυσιολογικές και λειτουργικές διαφορές κατά μήκος του διαφραγματο-κροταφικού άξονα της οδοντωτής έλικας, επιδρούν στην εξελισσόμενη νευρογένεση, οδηγώντας το διαφραγματικό τμήμα σε μία συνεχή, ταχεία και λιγότερο πειθαρχημένη παραγωγή νέων νευρώνων, ενώ το ήρεμο μικροπεριβάλλον του κροταφικού τμήματος συντηρεί μία λιγότερο απαιτητική και περισσότερο σταθερή νευρογένεση.