Παραγωγή και μελέτη μονοκλωνικών αντισωμάτων από ασθενείς με χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία

Abstract

In chronic lymphocytic leukemia (CLL), the existence of subsets of cases with closely homologous (“stereotyped”) B-cell receptors (BCRs) supports a role for antigen in driving the cell of origin, at least for subsets of cases. The implicated antigen(s) remain largely unknown. Therefore, it becomes crucial to analyze the BCRs in terms of specificity and affinity. In the present study, CLL monoclonal antibodies produced using hybridomas technology and recombinant DNA technology were tested against common (auto)antigens. Particularly interesting were the findings regarding the BcRs of stereotyped subsets #13 and #8.Through an immunogenetic approach we identified 12 cases mutated, stereotyped IGHV4-59/IGKV3-20 rearrangements of the immunoglobulin genes, carrying stereotyped somatic mutations (subset #13). In addition, two cases each with atypical CLL, one case with splenic marginal-zone lymphoma and one case with monoclonal B lymphocytosis from our groups were found to carry BcR homologous to subset #13. Homology was found also with a rheumatoid factor (RF), a CLL case with prior HCV-associated type-II mixed cryoglobulinemia (HCV/MC-II) and two cases with Sjögren's syndrome-associated myoepithelial sialadenitis (SS-MESA). Interestingly, remarkable immunogenetic similarities to HCV-associated MC-II have been reported for primary Sjögren's syndrome. In addition, 3 cases had positive hepatitis C virus (HCV) serology. Furthermore, subset #13 - specific IgM exhibited strong RF activity yet was not HCV-reactive, similar to the IgM RF in HCV/MC-II, where anti-HCV reactivity is mediated by polyclonal IgG forming immune complexes with the non-HCV-reactive monoclonal RF. In conclusion, in the present study, we demonstrate the existence of RF with restricted immunoglobulin gene sequences in various conditions including CLL, alluding to cross-reactivity or molecular mimicry of the antigenic elements selecting the clonogenic progenitors yet resulting in distinct pathological conditions.Finally, stereotyped subset #8 is defined by the expression of unmutated, IgG-switched IGHV4-39/IGKV1(D)-39 BcRs. Subset #8 patients experience aggressive clinical courses and exhibit the highest risk for Richter´s transformation (RT) among all CLL. In order to obtain biological insight into the underlying reasons for this behavior, we profiled the antigen reactivity of subset #8 vs. other stereotyped subsets, both good (subset #4) and bad prognosis (subsets #1 and #2). The CLL monoclonal antibodies were used as primary antibodies in ELISA assays against bacterial lipopolysaccharides, dsDNA and neo-epitopes created by oxidative stress.Subset #8 CLL monoclonal antibodies exhibited broad polyreactivity as they bound to all antigens tested, in clear contrast with the mAbs from all other stereotyped subsets and links promiscuous antigen reactivity of this distinct subset with clinical aggressiveness. An unlimited capacity to respond to multiple immune/inflammatory stimuli present in the microenvironment may elicit unabated stimulation thoughout the natural history of these patients, leading to progressive selection of the more aggressive clonal variants.

Στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ), η ύπαρξη υποσυνόλων ασθενών με ομόλογους («στερεότυπους») Β κυτταρικούς υποδοχείς (ΒΚΥ) υποστηρίζει το ρόλο της αντιγονικής διέγερσης στην ανάπτυξη της νόσου. Το εμπλεκόμενο(α) αντιγόνο(α) παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστα καθιστώντας κρίσιμη την ανάλυση των ΒΚΥ από άποψη ειδικότητας και συγγένειας. Στην παρούσα μελέτη, ΧΛΛ μονοκλωνικά αντισώματα παράχθηκαν με την τεχνολογία των υβριδωμάτων και του ανασυνδυασμένου DNA και εξετάστηκαν εναντίον κοινών (αυτό)αντιγόνων. Ενδιαφέρον παρουσίασαν τα ευρήματα που αφορούσαν τους ΒΚΥ των στερεότυπων υποσυνόλων #13 και #8.Μέσω ανοσογενετικών αναλύσεων εντοπίσαμε 12 ΧΛΛ περιπτώσεις που έφεραν μεταλλαγμένες, στερεότυπες αναδιατάξεις IGHV4-59/IGHD2-15/IGHJ2 των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών και στερεότυπες σωματικές μεταλλάξεις (υποσύνολο #13). Επιπλέον δυο ασθενείς με άτυπη ΧΛΛ, ένας ασθενής με Σπληνικό Λέμφωμα της Οριακής Ζώνης και μια περίπτωση μονοκλωνικής Β λεμφοκυττάρωσης βρέθηκαν να εκφράζουν τον στερεότυπο ΒΚΥ του υποσυνόλου #13. Ομοιότητες βρέθηκαν και με ένα ρευματοειδή παράγοντα (ΡΠ), έναν ΒΚΥ από ασθενή με ΧΛΛ, με ιστορικό μικτής κρυοσφαιριναιμίας τύπου ΙΙ (ΜΚΤΙΙ) και θετικότητα για anti-HCV (Hepatitis C Virus) αντισώματα και τις κλωνοτυπικές αλληλουχίες δύο ασθενών με μυοεπιθηλιακή σιελαδενίτιδα που αναπτύχθηκε στο πλαίσιο συνδρόμου Sjögren. Για το συνδρόμο Sjögren έχουν δημοσιευτεί σημαντικές ανοσογενετικές ομοιότητες με την HCV+ ΜΚΤΙΙ. Επιπλέον, 3 ασθενείς του υποσυνόλου #13 ήταν θετικοί για αντι-HCV αντισώματα στον ορό. Επιπλέον, η μονοκλωνική ανοσοσφαιρίνη ασθενούς του υποσυνόλου έδειξε ισχυρή δράση ΡΠ, ενώ δεν αντιδρούσε με αντιγόνα του ιού HCV, όπως συμβαίνει και με την IgM με δράση ΡΠ στην ΜΚΤ ΙΙ, όπου η αντι-HCV αντιδραστικότητα μεσολαβείται από πολυκλωνικές IgG ανοσοσφαιρίνες που σχηματίζουν ανοσοσυμπλέγματα με τον μονοκλωνικό ΡΠ. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία αποδεικνύουμε δράση ΡΠ για ένα υποσύνολο διακριτών υποδοχέων που εντοπίστηκαν σε ευρύ φάσμα Β λεμφοϋπερπλαστικών διαταραχών, συμπεριλαμβανομένης της ΧΛΛ και υποδεικνύουν την ύπαρξη μηχανισμών διασταυρούμενης αντιδραστικότητας ή μοριακού μιμητισμού των αντιγονικών στοιχείων που επιλέγουν τα πρόδρομα κακοήθη κύτταρα και οδηγούν σε ετερογενείς αλλά συναφείς κλινικές οντότητες.Τέλος, το στερεότυπο υποσύνολο #8 χαρακτηρίζεται από την έκφραση αμετάλλακτων στερεότυπων υποδοχέων IGHV4-39/IGKV1(D)-39, ισοτύπου IgG. Οι ασθενείς του υποσυνόλου #8 παρουσιάζουν επιθετική κλινική πορεία και την υψηλότερη καταγεγραμμένη πιθανότητα μετατροπής της ΧΛΛ σε επιθετικό λέμφωμα (σύνδρομο Richter). Με σκοπό να διαλευκάνουμε τη βιολογική βάση της επιθετικής συμπεριφοράς του υποσυνόλου #8, μελέτησαμε το πρότυπο της αντιγονικής αναγνώρισης των mAbs του υποσυνόλου σε σύγκριση με το αντίστοιχο πρότυπο των mAbs άλλων στερεότυπων υποσυνόλων είτε καλής πρόγνωσης (υποσύνολο #4) είτε κακής πρόγνωσης (υποσύνολα #1 και #2). Πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανοσοανίχνευσης τύπου ELISA όπου τα ΧΛΛ αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτογενή αντισώματα και ελέγχθηκε η αντιδραστικότητα έναντι βακτηριακών λιποπολυσακχαριτών, δίκλωνου DNA και νέο-αντιγόνων που παράγονται σε καταστάσεις οξειδωτικού στρες. Τα μονοκλωνικά αντισώματα του υποσυνόλου #8 παρουσίασαν έντονη πολυαντιδραστικότητα καθώς αναγνώρισαν όλα τα αντιγόνα του πάνελ. Το προφίλ της αντιγονικής αναγνώρισης των αντισωμάτων του υποσυνόλου #8 συνδέει την έντονη πολυαντιδραστικότητα των αντισωμάτων του υποσυνόλου με την κλινική επιθετικότητα. Πιθανόν, η απεριόριστη ικανότητα απόκρισης στα πολλαπλά ερεθίσματα του μικροπεριβάλλοντος μπορεί να διεγείρει συνεχώς τα λευχαιμικά κύτταρα καθ’ όλη τη διάρκεια της φυσικής ιστορίας της νόσου οδηγώντας στην προοδευτική επιλογή των πιο επιθετικών κλώνων.