Ο ρόλος της έψιλον ισομορφής της πρωτεϊνικής κινάσης C-ε στο μηχανισμό διαφοροποίησης των νευροβλαστών και των νευρώνων

Abstract

Neuronal development is tightly coupled to cell polarity and asymmetric distribution of signaling complexes. This spatial control of signaling alters gene transcription to guide neurons through divisions, differentiation, and neuroprotection. Previous work by and others has shown that PKCs, in particular PKC-e may regulate interactions of signalosomes with the cytoskeleton and transcription. Using the E14/T Embryonic Stem Cell (ESC) line and RT-PCR in undifferentiated ESCs, after formation of embryoid bodies (EBs), when EBs were neuronally induced with retinoic acid (RA), and after differentiation onto glutamergic neurons, we found that each developmental stage exhibited a characteristic PKC isoform profile. Moreover, while no PKC-e expression was detected in ESCs or EBs, its expression was induced with RA, reaching a significant 100-fold increase with neuronal differentiation; this exponential increase was confirmed by immunoblotting and immunocytochemistry. Deconvolution imaging showed that the subcellular localization of PKC-e is developmentally regulated and that it is polarized during process outgrowth. We obtained similar patterns in embryonic (E16) rat hippocampal neurons in culture. We then examined whether PKC-e affected development in these neurons early in culture, using nucleofection of PKC-e variants, tubulin (TUJ1) immunocytochemistry, and imaging. We found that both the wild type PKC-e and constitutively active PKC-e significantly induced neuritic length and arborization. Importantly, the dominant negative, kinase-dead form of PKC-e, increased only the number of bifurcations, suggesting a different role for the kinase and the protein as a scaffold. Taken together these data strongly indicate that PKC-epsilon may play a crucial role in the expression of the neuron-specific gene program.

Η νευρωνική διαφοροποίηση είναι στενά συνδεδεμένη με την πολικότητα των κυττάρων και την μη συμμετρική κατανομή των κυκλωμάτων σηματοδότησης. Ο έλεγχος της σηματοδότησης διαφοροποιεί την μετάφραση των γονιδίων και οδηγεί στη διαφοροποίηση των νευρώνων στη διαίρεσή τους και στην προστασία τους. Προηγούμενες έρευνες έχουν δείξει ότι η PKC-ε συμβάλλει στη διαφοροποίηση των νευρικών κυττάρων. Χρησιμοποιώντας εμβρυικά βλαστικά κύτταρα E14/T και το πρωτόκολλο διαφοροποίησης 4-/4+ για τη διαφοροποίησή τους επιτεύχθηκε η δημιουργία γλουταμεργικών νευρώνων. Με την τεχνική RT-PCR φάνηκε η διαφοροποίηση των επιπέδων του mRNA των διαφορετικών PKC στα διάφορα στάδια διαφοροποίησης προς νευρώνες. Τα πειραματικά δεδομένα έδειξαν ότι η PKC-ε αυξάνεται σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης κατά τα στάδια διαφοροποίησης των εμβρυικών βλαστικών σε νευρώνες. Με μικροσκόπηση αποπεριέλιξης και συνεστίασης διαπιστώθηκε ότι η PKC-ε μεταφέρεται κατά την διάρκεια της δημιουργίας του κεντρικού νευράξονα στο σύστημα Golgi. Από τη βιβλιογραφία φαίνεται ότι σε εκείνο το τμήμα του κυττάρου γίνονται οι διεργασίες που είναι απαραίτητες για την επιμήκυνση του νευράξονα. Για να διευκρινισθεί αυτό διαμολύναμε νευρώνες ιππόκαμπου από έμβρυα 16 ημερών με τον άγριο τύπο και με μεταλλάξεις του γονιδίου της PKC-ε. Βρέθηκε ότι ο άγριος τύπος και η συνεχώς ενεργοποιημένη μορφή της πρωτεΐνης αύξησαν το μήκος των νευριτών και τις διακλαδώσεις τους. Η απενεργοποιημένη μορφή της πρωτεΐνης αύξησε τις διακλαδώσεις. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η PKC-ε παίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των νευρώνων.