Μηχανισμοί μεταγωγής σήματος σε διαφοροποιούμενα νευρωνικά κύτταρα

Abstract

Neurofibromatosis type 1 (NF1), an inherited disease of humans, progressively affectsthe function of many tissues, including CNS, where it is manifested primarily asuncontrolled growth (pilocytic astrocytomas) and aberrant differentiation (learningdisabilities or mental retardation). The NF1 gene encodes neurofibromin, a large 2839amino acid RasGAP protein that is highly expressed in the developing CNS and PNS.The RasGAP activity is due to the presence of a central 360 aa domain (GRD). Thefunction of GRD domain as a RasGAP and it’s impact on the Ras/Raf/MEK/ERKsignal transduction pathway, which regulates the temporal and spatial patterns ofcellular proliferation and differentiation in neuronal cells, is well established althoughthe role of other region or domains of the protein as allosteric regulators of GRDfunction remains elusive.In the first part of this Thesis the function of the SEC14 domain of NF1 on theregulation of GRD was studied. Several domains of NF1 were fused to EGFP proteinto create plasmid constructs and overexpressed in cell lines. These experiments haveshown that the Sec14 domain regulates positively the GRD function and furthermore,presents a very different pattern of subcellular localization with a pool of intracellularSEC14 protein localised in Golgi complex.In the second part of this Thesis the role of Neurofibromin on neurite sprouting ofPC12 cell line, an established model of sympathetic neuronal differentiation, wasstudied using RNA interference. Using a Ras affinity precipitation assay, a significanthyperactivation (elevated Ras-GTP) of all Ras isoforms (Ha-, Ki-, and N-Ras) wasobserved in response to NGF treatment only in cells where neurofibromin levels hadbeen reduced by RNAi. Moreover, hyperactivation was also noticed in downstreameffectors in the pathway, namely Erk1/2 and Mek/1/2. In addition, upon treatmentwith NGF a significant increase in neuritogenesis and neurite outgrowth wasobserved. Most importantly, these effects were reversed with transient overexpressionof the GRD domain of Neurofibromin. Furthermore, the silence of NF1 gene causedan overexpression of neuronal differentiation markers, such as TH and Synapsin I.The same results were obtained in experiments where the NF1 gene was silenced inembryonic rat cortical neurons. C6 rat glioma cells that overexpress the GRDIIisoform of Nurofibromn, exhibit changes in the tubulin cytoskeleton and reduction in the protein levels of GS and GFAP. While gross morphological changes in neurons ofNF1 knock-out mice have not been observed, abnormalities in cortical neuronlayering have been documented in human autopsy material, and therefore more subtlemorphological differences known to have an impact on neuronal plasticity andlearning and memory are expected in Neurofibromatosis type 1. Thus, taken togetherthese results strongly suggest that Neurofibromin exerts a Ras signalling-dependentregulation of neuritogenesis and neurite outgrowth through it’s GTPase catalyticactivity

Το γονίδιο ΝF1 κωδικοποιεί τη Νευρινωμίνη, μια μεγάλη πρωτεΐνη με δραστικότηταRasGAP, μεγέθους 2839 αμινοξέων. Η δραστικότητα RasGAP εντοπίζεται σε μιακεντρική επικράτεια, την GRD, η οποία συναντάται σε δύο μετάγραφα, την GRDI καιτην GRDII, και ενδέχεται να ρυθμίζεται από άλλες περιοχές ή επικράτειες τηςΝευρινωμίνης. Σε αυτή τη μελέτη, εξετάζεται εάν η επικράτεια SEC14 τηςπρωτεΐνης, μια πιθανή θέση πρόσδεσης λιπιδίων και πρωτεϊνών, λειτουργεί με τρόποώστε να ρυθμίζει τη δραστικότητα RasGAP της GRD. Η υπερέκφραση της SEC14,συνενωμένης με την Πράσινη Φθορίζουσα Πρωτεΐνη (EGFP), έδειξε ότι η SEC14εντοπίζεται κυρίως σε περινουκλεϊκή περιοχή, μέρος της οποίας την καταλαμβάνει τοσύμπλεγμα Golgi. Επιπλέον, υπό την επίδραση NGF, η συνένωση της επικράτειαςSEC14 με την GRD (SEC14GRD) προκαλεί μεγαλύτερη απενεργοποίηση της Ras,συγκρινόμενη με τη δραστικότητα της απομονωμένης GRD. Η απενεργοποίηση τηςRas από την SEC14GRD οδήγησε σε σημαντική εξασθένιση της φωσφορυλίωσης τηςErk1/2, μετά από επίδραση NGF. Ακόμα, η επικράτεια SEC14 ενισχύει την αρνητικήρύθμιση της GRDI στη νευριτογένεση και νευριτική αύξηση.Η υπερέκφραση του μεταγράφου GRDII της Νυερινωμίνης σε κύτταρα C6,προκαλούσε αλλαγές στο φαινότυπο τους τόσο δομικές όσο και βιοχημικές. Οιαλλαγές εντοπίζονταν στον κυτταροσκελετό τουμπουλίνης καθώς και στην έκφρασηπρωτεϊνών χαρακτηριστικών για τα αστροκύτταρα.Η αποσιώπηση της Νευρινωμίνης σε κύτταρα PC12TetOff οδηγεί σε αύξηση τηςενεργοποίησης των πρωτεϊνών Ras και Erk1/2, μετά από επίδραση NGF. Επίσης, έχειως συνέπεια την αύξηση των επιπέδων έκφρασης των πρωτεϊνών Υδροξυλάση τηςΤυροσίνης και της Συναψίνης Ι σε αυτά τα κύτταρα. Η αυξημένη νευριτογένεση και ηεντονότερη νευριτική αύξηση, που παρατηρήθηκαν σε αυτά τα κύτταρα μετά απόεπίδραση NGF, οφειλόταν στην αυξημένη φωσφορυλίωση της Erk1/2 πουπροκαλούσε η αποσιώπηση της Νευρινωμίνης. Επίσης, αυξημένη νευριτικήεπιμήκυνση παρατηρήθηκε και σε καλλιέργειες από πρωτοταγείς φλοιϊκούς νευρώνεςεγκεφάλου εμβρύων επίμυος. Αυτός ο φαινότυπος παρατηρήθηκε και όταν σε αυτέςτις καλλιέργειες προστέθηκε ο BDNF. Ο BDNF ενίσχυε τη νευριτική αύξηση σεπρωτοταγείς νευρώνες, στους οποίους είχε αποσιωπηθεί η Νευρινωμίνη με τη μέθοδοτης παρεμβολής RNA. Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη καταδεικνύει για πρώτη φορά ότι η επικράτειαSEC14 της νευρινωμίνης προσδίδει μια νέα ρύθμιση αυτής της πρωτεΐνης, τόσο στηδραστικότητα GΑP, αλλά και στον υποκυτταρικό εντοπισμό της. Ακόμα,καταδεικνύει ότι η Νευρινωμίνη ρυθμίζει τη νευριτική αύξηση και νευριτογένεση μετρόπο που εξαρτάται από την καταλυτική δραστικότητά της. Τέλος, η Νευρινωμίνηρυθμίζει την έκφραση πρωτεϊνών που έχουν σχέση με τη σύνθεση και απελευθέρωσηνευροδιαβιβαστών, κάνοντας ελκυστική την υπόθεση ότι, μέσω τέτοιων μηχανισμών,η Νευρινωμίνη επηρεάζει τη λειτουργία συγκεκριμένων νευρώνων και, κατάσυνέπεια, τις γνωσιακές λειτουργίες