Ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης (PKC) από διακυλογλυκερόλη και φωσφορυλίωση της νευροϊνιδίνης

Abstract

In the present study we explored the role of neurofibromin, mutations of which causelearning difficulties. Neurofibromin is a GTPase Activating Protein (GAP) that has beenshown to regulate Ras activity. We initially studied the expression of neurofibromin and HRasduring differentiation of the CNS. We showed that both neurofibromin and H-Ras aredevelopmentally regulated, but in a different manner. Neurofibromin regulates Ras activityand transcription by changing the duration and intensity of the Ras-dependent ERKactivation. Next, we assessed the expression of GRDI and GRDII transcripts ofneurofibromin that present differential RasGAP activity. We found that although the sum ofthe two transcripts change similarly to the protein, GRDI expression preferentially increasedcompared to GRDII expression, a finding that was further confirmed with the use ofdifferentiating factors like PKCε and retinoic acid on a neuroblastoma cell line. Furthermore,NLS transcript of neurofibromin that targets the protein to the nucleus seems to bedevelopmentally regulated. Namely, NLS transcript dramatically decreased and was almostabolished during differentiation. Moreover, we investigated the subcellular distribution ofneurofibromin and found that neurofibromin located at different subcellular compartmentslike the endoplasmic reticulum, actin and microtubule cytoskeleton as well as the lipid raftsand the nucleus. More specifically, neurofibromin localization at the lipid rafts: a) wasregulated by PKCε phosphorylation, b) inhibited Ras activity and c) showed differentialdistribution during development possibly due to the differences observed in the primarysequence of GRDI and GRDII transcripts. Examining the ability of NF-GRDI and NFGRDIIisoforms to bind the cytoskeleton we showed that GRDII preferentially binds actin,while GRDI microtubules. Moreover, GRDI overexpression induced significant increases inneurite length. More importantly, we found that neurofibromin interacts with PSD proteins.Namely, using differentiating agents that eliminate GRDII and NLS transcipts, we showedthat neurofibromin binds to neuroligin 3 a known synaptic protein. Therefore, differentneurofibromin isoforms induce differential signaling regulating specific biological outcomes.

Στην παρούσα εργασία προσπαθήσαμε να σκιαγραφήσουμε τους μηχανισμούς ρύθμισης τηςνευρικής διαφοροποίησης στο KNΣ από την πρωτεΐνη Νευροϊνιδίνη, μεταλλάξεις της οποίαςπροκαλούν μαθησιακές δυσκολίες. Η Νευροϊνιδίνη είναι μία RasGAP πρωτεΐνη, κύριαλειτουργία της οποίας είναι η ρύθμιση της δραστικότητας της Ras. Αρχικά μελετήθηκε ηέκφραση της Νευροϊνιδίνης και της Ras κατά τη διάρκεια διαφοροποίησης του ΚΝΣχρησιμοποιώντας πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων από τελεγκέφαλο εμβρύου όρνιθας.Οι δύο πρωτεΐνες ρυθμίζονται εξελικτικά με διαφορετικό όμως πρότυπο. Η Νευροϊνιδίνηρυθμίζει τη δραστικότητα της Ras και πιθανόν και τη μεταγραφή της, μέσα από τιςμεταβολές στη διάρκεια και ένταση που επιφέρει στην Ras-εξαρτώμενη σηματοδοτικήενεργοποίηση της ERK. Η ανάλυση της έκφρασης των μεταγράφων GRDI και GRDII τηςΝευροϊνιδίνης ακολουθεί το πρότυπο της πρωτεΐνης, όμως η έκφραση του GRDI αυξάνειέναντι του GRDII κατά τη διαφοροποίηση. Το εύρημα αυτό επιβεβαιώθηκε και με χρήσηκυττάρων νευροβλαστώματος μετά την επίδραση παραγόντων διαφοροποίησης, όπωςρετινοϊκό οξύ και PKCε. Ταυτόχρονα μελετήθηκε και η έκφραση του μεταγράφου NLSυπεύθυνου για την μεταφορά της πρωτεΐνης στον πυρήνα. Το μετάγραφο αυτό είναιαναπτυξιακά ρυθμιζόμενο ενώ κατά τη διαφοροποίηση τείνει να εξαλείφεται. Επιπλέονπροσδιορίστηκε η υποκυτταρική κατανομή της Νευροϊνιδίνης, η οποία εντοπίστηκε σεπολλαπλά μέρη του κυττάρου όπως στο κυτταροσκελετό ακτίνης και μικροσωληνίσκων καιστις λιπιδικές σχεδίες. Ειδικότερα, η παρουσία της στις λιπιδικές σχεδίες παρουσίασεδιαφορετική κατανομή κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Επίσης διαπιστώθηκε ότι ηΝευροϊνιδίνη μεταφέρεται στις λιπιδικές σχεδίες μετά από φωσφορυλίωση από την PKCε,στις οποίες και αναστέλλει τη δραστικότητα του Ras. Η δέσμευση των GRDI και GRDII,περιοχών της Νευροϊνιδίνης στα κυτταροσκελετικά συστήματα, παρουσίασε ακόμα μιαδιαφορά μεταξύ των δυο περιοχών, το GRDII μπορεί και δένεται με την ακτίνη, ενώ τοGRDI σχεδόν αποκλειστικά με τους μικροσωληνίσκους. Γνωρίζοντας ότι η ισομορφή GRDIείναι κυρίαρχη κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης, εξετάστηκε η πιθανή επίδρασή τηςστο φαινότυπο ώριμων νευρώνων, όπου και προκάλεσε σημαντική αύξηση του μήκους τουκύριου νευρίτη. Οι σαφείς διαφορές που παρουσιάζουν οι δύο ισομορφές καθώς και οεντοπισμός τους στις άκρες των νευριτών μας προέτρυναν να εξετάσουμε την πιθανήαλληλεπίδραση της Νευροϊνιδίνης με πρωτεΐνες της PSD. Κατά την επίδραση παραγόντωνδιαφοροποίησης παρατηρήθηκε σύνδεση της με την πρωτεΐνη Neuroligin 3.