Διαφοροποίηση αμιγών ελληνικών μελιών πορτοκαλιάς, θυμαριού και βαμβακιού με βάση τα πτητικά συστατικά τους

Abstract

In this dissertation, two methods for the isolation of volatile compounds from honey are presented, namely ultrasound-assisted extraction (USE) and solid-phase microextraction (SPME). USE leads to the isolation of a variety of polarities and volatilities among the isolated compounds. Moreover, semi-volatile compounds are isolated, among which potent botanical markers can be identified. An advantage of this technique is the limited time it requires. One of the drawbacks is related to the low recovery of very polar compounds. SPME requires very low sample volumes. In this work, the complex fiber was used that comprises of three phases (DVB/CAR/PDMS), allowing the isolation of compounds of no to medium polarity. These two methods were compared with two known distillation, microsteam distillation-extraction (MSDE) and hydrodistillation (HD). The aforementioned distillation techniques were proved unsuitable for honey volatile compounds, as many artifacts are generated because of the heat employed. Moreover, thermally sensitive components are degraded. The main purpose of this dissertation is to identify marker compounds of botanical origin for three types of unifloral Greek honeys, orange (Citrus spp.), thyme (Corydothymus capitatus) and cotton (Gossypium hirsutum). The samples of orange honey were from four regions of Greece (Arta, Chania, Argos and Lakonia) and from Italy, while thyme honey samples were from Crete, Leros, Kalumnos and Kos. Regarding orange honey, a plethora of compounds were identified, mostly, linalool derivatives, that were absent in honeys of different botanical origin. (£)-8-hydroxylinalool is the best botanical marker, while (Z)-8- hydroxylinalool, (£)-2,6-dimethyl-6-hydroxy-2,7-octadienal, methyl anthranilate, indole, oxoindole, 8-heptadecene, caffeine and the three isomers of lilac aldehydes are characteristic compounds isolated in significant proportions. Statistical evaluation of the data obtained allowed good discrimination of the regions of origin, with samples from Italy and Lakonia being more clearly differentiated. Thyme honey is characterised by the presence of phenolic compounds and phenylacetaldehyde, 3-hydroxy-4-phenyl-2-butanone, 3-hydroxy-l-phenyl-2-butanone, 1- phenyl-2,3-butanedione, 3-hydroxy-4-phenyl-3-buten-2-one and phenylacetonitrile can be used as potent botanical markers. Statistical analysis employed allowed a clear geographical characterisation of the samples, with those from Crete being more clearly discriminated. Cotton honey is also predominated by phenolic substances. Phenylpropanol, lilial, cis- and trans-p-methoxy-cinnamic acids, coniferaldehyde, trans-p-coumaric acid, cis- and trans-3,4-dimethoxy-cinnamic acids and ferulic acid were isolated exclusively from cotton honey using USE. The volatile profile obtained with SPME was very poor, with phenylpropanol, trans-cinnamaldehyde and increased proportions of phenylethyl alcohol adequately marking this type of honey. Apart from these types of honey, a small number of honeys of different botanical origin were investigated and potent botanical markers seem to exist for chestnut (Castanea sativa), eucalyptus (Eucalyptus spp.), strawberry-tree (Arbutus unedo) and heather (Erica spp.) honeys. In order to study the impact of heat on the volatile profile of honeys, orange and thyme honeys were employed. The compounds generated are quantitatively and qualitatively different for the two types of honey. Caffeine is a known marker compound for orange honey. For this, an easy and short isolation procedure was developed, with CH₂CI₂ as the extraction solvent. Average concentration for Greek samples was 3,82 mg/Kg honey (1,02-7,95 mg/Kg). The concentrations of Greek samples were not statistically different from those found for Italian samples (p=0,093).

Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκαν δύο μέθοδοι απομόνωσης των πτητικών συστατικών από το μέλι. Η πρώτη αφορά στη εκχύλιση των ουσιών από υδατικό διάλυμα μελιού με τη βοήθεια των υπερήχων (ultrasound-assisted extraction, USE) και σαν εκχυλιστικό ένα σύστημα διαλυτών πεντάνιο:διαιθυλαιθέρας 2:1. Η δεύτερη είναι γνωστή ως μικροεκχύλιση στερεής φάσης (solid-phase microextraction, SPME) και αφορά στην απομόνωση των πτητικών συστατικών από τον υπερκείμενο χώρο του μελιού με τη βοήθεια κατάλληλης συσκευής. Η ίνα που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από τρεις φάσεις (DVB/CAR/PDMS), κατάλληλη για την απομόνωση ουσιών ποικίλης πολικότητας. Η μέθοδος USE οδηγεί στην απομόνωση ουσιών μεγάλου εύρους πολικότητας και πτητικότητας, δίνοντας μια αντιπροσωπευτική εικόνα των πτητικών συστατικών του μελιού. Επίσης, με τη διαδικασία αυτή παραλαμβάνονται και λιγότερο πτητικές ουσίες, ανάμεσα στις οποίες αναγνωρίστηκαν δυνητικοί βοτανικοί δείκτες. Στα θετικά της μεθόδου περιλαμβάνεται και ο σύντομος χρόνος που απαιτείται. Η μέθοδος SPME φαίνεται να πλεονεκτεί έναντι της προηγούμενης στο ότι δεν εκχυλίζονται ουσίες με μεγάλο μοριακό βάρος που θα μπορούσαν να ρυπάνουν τη στήλη του αέριου χρωματογράφου. Οι δύο αυτές μέθοδοι συγκρίθηκαν με δύο μεθόδους απόσταξης, τη μικροαπόσταξη με τη συσκευή Likens-Nickerson και την υδροαπόσταξη, οι οποίες μειονεκτούν κυρίως στο ότι προϋποθέτουν τη θέρμανση του δείγματος, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία πολλών παραπροϊόντων, αλλά και τη διάσπαση θερμικώς ευαίσθητων ουσιών. Ο σκοπός της διατριβής αυτής είναι η αναγνώριση ουσιών που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως βοτανικοί δείκτες για τα μέλια της πορτοκαλιάς, του θυμαριού και του βαμβακιού. Ελήφθησαν δείγματα από 5 περιοχές στην περίπτωση της πορτοκαλιάς (Άρτα, Χανιά, Άργος, Λακωνία και Ιταλία) και 4 περιοχές στην περίπτωση του θυμαρίσιου μελιού (Κρήτη, Λέρος, Κάλυμνος και Κως). Αναφορικά με το μέλι πορτοκαλιάς, αναγνωρίστηκε πληθώρα ουσιών, κυρίως παράγωγα της λιναλοόλης, οι οποίες δε βρέθηκαν σε κάποιον άλλον τύπο μελιού. Η (Ε)-8-υδροξυλιναλοόλη αναγνωρίστηκε ως ο καλύτερος βοτανικός δείκτης, ενώ το έτερο ισομερές, η (Ζ)-8-υδροξυλιναλοόλη, μαζί με τις ουσίες (Ε)-2,6-διμεθυλο-6- υδροξυ-2,7-οκταδιενάλη, ανθρανιλικό μεθυλεστέρα, ινδόλιο, οξοϊνδόλιο, 8-δεκαεπτένιο, καφεΐνη και τα ισομερή της λιλακαλδεΰδης αποτελούν επίσης χαρακτηριστικές ουσίες και βρίσκονται σε σημαντική συγκέντρωση. Η στατιστική επεξεργασία των δεδομένων οδήγησε στο σαφή διαχωρισμό των περιοχών προέλευσης των δειγμάτων, ειδικά δε αυτών από τη Λακωνία και την Ιταλία. Το θυμαρίσιο μέλι χαρακτηρίζεται από την παρουσία φαινολικών ουσιών, με τις ουσίες φαινυλακεταλδεΰδη, 3-υδροξυ-4-φαινυλο-2-βουτανόνη, 3-υδροξυ-1 -φαινυλο-2-βουτανόνη, 1-φαινυλο-2,3-βουτανοδιόνη, 3-υδροξυ-4-φαινυλο-3-βουτεν-2-όνη και φαινυλακετονιτρίλιο να είναι οι πιο χαρακτηριστικές. Η στατιστική ανάλυση επέτρεψε τον γεωγραφικό διαχωρισμό των περιοχών προέλευσης των δειγμάτων, ιδιαίτερα αυτά από την Κρήτη. Το μέλι από βαμβάκι επίσης χαρακτηρίζεται από φαινολικά συστατικά. Από το μέλι βαμβακιού και μόνο απομονώθηκαν οι ουσίες φαινυλοπροπανόλη, λιλιάλη, cis- και trans-π-μεθοξυκινναμωμικό οξύ, κωνιφεραλδεΰδη, irarcs-π-κουμαρικό οξύ, cis- και trans-3,4- διμεθοξυ-κινναμωμικό οξύ και φερουλικό οξύ, ενώ σε μεγαλύτερη συγκέντρωση από άλλα μέλια συναντάμε το φαινυλοξικό και φαινυλοπροπανοϊκό οξύ και το trans-κινναμωμικό οξύ μαζί με την αντίστοιχη αλκοόλη και αλδεΰδη. Εκτός από τα μέλια αυτά, μελετήθηκε μικρός αριθμός δειγμάτων και από άλλους τύπους μελιών και φαίνεται ότι δυνητικοί βοτανικοί δείκτες υπάρχουν για τα μέλια καστανιάς, ευκαλύπτου, κουμαριάς και ερείκης. Μικρή προσέγγιση έγινε στην επίδραση της θέρμανσης στο πτητικό προφίλ των μελιών πορτοκαλιάς και θυμαριού. Οι αναλύσεις έδειξαν ότι οι ουσίες που σχηματίζονται, τόσο ποιοτικά, όσο και ποσοτικά, είναι διαφορετικές στην περίπτωση διαφορετικών μελιών. Η καφεΐνη αποτελεί χρήσιμο βοτανικό δείκτη του μελιού πορτοκαλιάς, καθώς η παρουσία της δεν έχει αναφερθεί σε κανέναν άλλον τύπο μελιού. Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκε μια απλή και σύντομη μέθοδος απομόνωσης, με το CH₂CI₂ σαν μέσο εκχύλισης. Η προέλευση της καφεΐνης του μελιού πορτοκαλιάς είναι το νέκταρ των εσπεριδοειδών. Η μέση συγκέντρωση της καφεΐνης στα ελληνικά δείγματα είναι 3,82 mg/Kg μελιού (1,02-7,95 mg/Kg), η οποία δε διαφέρει στατιστικώς σημαντικά από αυτή των μελιών της Ιταλίας (p=0,093).