Περίληψη
Περίπου το 1/3 των πρωτεϊνών που παράγονται στο κυτταρόπλασµα ενόςβακτηριακού κυττάρου, έχουν ως τελικό προορισµό εξωκυτταροπλασµατικάδιαµερίσµατα. Ωστόσο, η κυτταροπλασµατική µεµβράνη αποτελεί ένα αδιαπέραστοφράγµα, που συγκρατεί τα µακροµόρια της ζωής διαµερισµατοποιηµένα. Ηδιαπεραίωση των πρωτεϊνών µέσω της κυτταροπλασµατικής µεµβράνης δεν είναιθερµοδυναµικά αυθόρµητη διαδικασία. Για να µπορούν να υλοποιούν αυτή τηνδιαδικασία τα κύτταρα έχουν αναπτύξει τουλάχιστον 16 εκκριτικά συστήµατα. Απόαυτά το Sec σύστηµα, το επίκεντρο αυτής της µελέτης, είναι το µοναδικό πουβρίσκεται σε όλα τα κύτταρα των ζωντανών οργανισµών και είναι απαραίτητο γιατην ζωή.Στα βακτήρια το σύστηµα Sec αποτελείται από το διαµεµβρανικό σύµπλοκο SecY,SecE, SecG (SecYEG), που δηµιουργεί τον δίαυλο µέσω του οποίου εξέρχονται οιπρωτεΐνες, και τον κυτταροπλασµατικό κινητήρα SecA.Οι πρωτεΐνες που προορίζονται για τον χώρο πέρα από την κυτταροπλασµατικήµεµβράνη, συντίθενται σαν προπρωτεΐνες και διαθέτουν µια µικρή (20-3 ...
Περίπου το 1/3 των πρωτεϊνών που παράγονται στο κυτταρόπλασµα ενόςβακτηριακού κυττάρου, έχουν ως τελικό προορισµό εξωκυτταροπλασµατικάδιαµερίσµατα. Ωστόσο, η κυτταροπλασµατική µεµβράνη αποτελεί ένα αδιαπέραστοφράγµα, που συγκρατεί τα µακροµόρια της ζωής διαµερισµατοποιηµένα. Ηδιαπεραίωση των πρωτεϊνών µέσω της κυτταροπλασµατικής µεµβράνης δεν είναιθερµοδυναµικά αυθόρµητη διαδικασία. Για να µπορούν να υλοποιούν αυτή τηνδιαδικασία τα κύτταρα έχουν αναπτύξει τουλάχιστον 16 εκκριτικά συστήµατα. Απόαυτά το Sec σύστηµα, το επίκεντρο αυτής της µελέτης, είναι το µοναδικό πουβρίσκεται σε όλα τα κύτταρα των ζωντανών οργανισµών και είναι απαραίτητο γιατην ζωή.Στα βακτήρια το σύστηµα Sec αποτελείται από το διαµεµβρανικό σύµπλοκο SecY,SecE, SecG (SecYEG), που δηµιουργεί τον δίαυλο µέσω του οποίου εξέρχονται οιπρωτεΐνες, και τον κυτταροπλασµατικό κινητήρα SecA.Οι πρωτεΐνες που προορίζονται για τον χώρο πέρα από την κυτταροπλασµατικήµεµβράνη, συντίθενται σαν προπρωτεΐνες και διαθέτουν µια µικρή (20-30αα)αµινοτελική αµινοξική αλληλουχία που αποκαλείται πεπτίδιο σήµα και αποκόπτεταιµετά την ολοκλήρωση της µετατόπισης τους µέσω του συµπλόκου SecA-SecYEG. Τουπόλοιπο τµήµα της προπρωτεΐνης αποκαλείται ώριµο τµήµα. Η SecA αλληλεπιδράµε τις προπρωτεΐνες στο κυτταρόπλασµα ή αφού έχει προηγουµένως σχηµατίσεισύµπλοκο µε την SecYEG στην µεµβράνη. Στην συνέχεια η SecA καταναλώνειενέργεια (µε την µορφή ΑΤΡ) για να παράγει το απαραίτητο µηχανικό έργο πουχρειάζεται για την ώθηση των προπρωτεϊνών µέσω της SecYEG. Μετά από µερικούςκύκλους υδρόλυσης ΑΤΡ το πεπτίδιο σήµα αποκόπτεται και η πρωτεΐνη πλέον,απελευθερώνεται στον κυτταροπλασµατικό χώρο όπου και παραµένει ή µετακινείταιπεραιτέρω µε την βοήθεια άλλων συστηµάτων.Στόχος της συγκεκριµένης εργασίας ήταν ο προσδιορισµός της περιοχής της SecA µετην οποία αλληλεπιδρούν οι προπρωτεΐνες και του µηχανισµού µε το οποίο αυτή ηαλληλεπίδραση ενεργοποιεί την υδρόλυση του ΑΤΡ και την παραγωγή µηχανικούέργου έκκρισης.Τα αποτελέσµατα της µελέτης µας δείχνουν ότι οι προπρωτεΐνες αλληλεπιδρούν µετην ρηχή κυτταροπλασµατική επιφάνεια της SecA, όταν αυτή βρίσκεται σε σύµπλοκο µε την SecYEG. Τα πεπτίδια σήµατα και τα ώριµα τµήµατα των προπρωτεϊνών έχουνανεξάρτητες θέσεις πρόσδεσης πάνω στην SecA. Η θέση πρόσδεσης του ώριµουτµήµατος βρίσκεται στην κυτταροπλασµατική επιφάνεια που σχηµατίζεται από τις 4περιοχές της SecA, την περιοχή πρόσδεσης του νουκλεοτιδίου (NBD, NucleotideBinding Domain), την περιοχή ενδοµοριακής ρύθµισης της υδρόλυσης του ΑΤΡ-2(IRA2, Intramolecular Regulator of ATP-hydrolysis 2) την περιοχή πρόσδεσης τωνπροπρωτεϊνών (PBD, Preprotein Binding Domain) και την καρβοξυτελική περιοχή(C-domain). Η θέση αλληλεπίδρασης των πεπτιδίων σηµάτων βρίσκεται σε µια ρηχήκοιλότητα που σχηµατίζεται κατά µήκος της PBD. Το ώριµο τµήµα ενδέχεται νααλληλεπιδρά πρώτο µε την SecΑ, καθώς στις περισσότερες προπρωτεΐνες έχει πολύµεγαλύτερο µέγεθος από ο πεπτίδιο σήµα, γεγονός που καθιστά την στοχαστικήπρόσδεση του πιο πιθανή. Η PBD περιστρέφεται και φέρνει τις δυο ανεξάρτητεςθέσεις πρόσδεσης στον κατάλληλο προσανατολισµό για να επιτευχθεί βέλτιστησυνεργατική αλληλεπίδραση της προπρωτεΐνης (πεπτίδιο σήµα και ώριµο τµήµα) µετην SecA.Η αρχική αλληλεπίδραση των προπρωτεϊνών µε το σύµπλοκο SecA-SecYEG, επάγειτην µετάδοση ενός σήµατος ενεργοποίησης, που τελικά οδηγεί στην παραγωγήµηχανικού έργου µετακίνησης της προπρωτεΐνης. Η µετάδοση αυτού του σήµατοςγίνεται µέσω µιας αλληλουχίας δοµικών µεταβολών κατά µήκος της SecA. Αρκετάεπιφανειακά αµινοξικά κατάλοιπα στην PBD συµµετέχουν σε αυτή τηνενεργοποίηση, µέσω της αλληλεπίδρασής τους µε το SecYEG και άλλες πρωτεΐνες.Επιπλέον, η θέση της PBD φαίνεται πως ρυθµίζει την ενεργοποίησης του ολοενζύµουSecA-SecYEG. Ωστόσο, η περιστροφική κίνηση της PBD δεν είναι το µηχανικόγεγονός που οδηγεί στην ώθηση των προπρωτεϊνών µέσω του SecYEG.Ένας επιπλέον µηχανισµός που χρησιµοποιεί η SecA για να ελέγχει τηνενεργοποίηση της είναι η µεταβολή της ολιγοµερικής της κατάστασης. Η SecAαρχικά αλληλεπιδρά µε την SecYEG και τις προπρωτεΐνες και ενεργοποιείται απόαυτές σαν διµερές. Ωστόσο, στην συνέχεια η SecA πρέπει να µονοµεριστεί για ναολοκληρωθεί η παγίδευση και η µετατόπιση της προπρωτεΐνης µέσω του διαύλου πουσχηµατίζει η SecYEG
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
About 1/3 of the proteins produced in the cytoplasm of bacteria need to betranslocated to extracytoplasmic locations. The cytoplasmic membrane is animpenetrable barrier that holds life’s macromolecules compartmentalized. Proteincrossing of the membrane hydrophobic bilayer is thermodynamically unfavorable anddoes not occur spontaneously. To tackle this challenge, cells have evolved at least 16systems to translocate proteins into and across the cytoplasmic membrane. One ofthese, the Sec system is the only ubiquitous and essential for viability.In bacteria the Sec system consists of the SecY/SecE/SecG (SecYEG hereafter)membrane-embedded heterotrimeric complex, which forms the channel throughwhich proteins are threaded, and the cytoplasmic motor SecA.Proteins destined to be translocated outside the cytoplasmic membrane are producedas preproteins, bearing short and conserved aminoterminal extensions called signalpeptides and mature domains, that are not conserved in their length orphysicoch ...
About 1/3 of the proteins produced in the cytoplasm of bacteria need to betranslocated to extracytoplasmic locations. The cytoplasmic membrane is animpenetrable barrier that holds life’s macromolecules compartmentalized. Proteincrossing of the membrane hydrophobic bilayer is thermodynamically unfavorable anddoes not occur spontaneously. To tackle this challenge, cells have evolved at least 16systems to translocate proteins into and across the cytoplasmic membrane. One ofthese, the Sec system is the only ubiquitous and essential for viability.In bacteria the Sec system consists of the SecY/SecE/SecG (SecYEG hereafter)membrane-embedded heterotrimeric complex, which forms the channel throughwhich proteins are threaded, and the cytoplasmic motor SecA.Proteins destined to be translocated outside the cytoplasmic membrane are producedas preproteins, bearing short and conserved aminoterminal extensions called signalpeptides and mature domains, that are not conserved in their length orphysicochemical properties. Signal peptides are cleaved once the translocation of thepreprotein is almost completed. SecA interacts with preproteins in the cytoplasm orafter it has formed a complex with SecYEG at the membrane. Next SecA consumesenergy in the form of ATP, to produce mechanical work that somehow pushes andthreads preproteins through the SecYEG pore. After a few cycles of ATP hydrolysis(depending on the size of the preproteins) the signal peptide is cleaved and the maturedomain is released in the periplasmic space for further processing.The aim of this study was to determine the region on the translocase holoenzyme(SecA-SecYEG) where preproteins dock for the first time. We also wanted todetermine which are the molecular/structural events that lead to the activation of thetranslocase in response to preprotein binding.Our results show that preproteins interact with the flat cytoplasmic surface of SecA,when in complex with SecYEG. Signal peptides and mature domains utilizeindependent binding sites on SecA; mature domains bind on the flat surface formedby all 4 domains of SecA(NBD, Nucleotide Binding Domain, IRA2, IntramolecularRegulator of ATP-hydrolysis 2, PBD, Preprotein Binding Domain and the C-domain);and signal peptides bind on a shallow groove along PBD. Mature domains might interact first with SecA due to their sheer size (in relation to the signal peptide)making their stochastic binding more probable. PBD rotates to adjust the spacingbetween the two independent binding sites in order to ensure optimal synergisticpreprotein binding (signal peptide and mature domain binding).The initial interaction of preproteins with the SecA-SecYEG complex induces thetransmition of an activation signal that leads to the production of preproteintranslocation mechanical work. The transmition of the activation signal occurs throughstructural alterations that occur throughout SecA. Amino acids on the surface of PBDparticipate in the transduction of the activation signal through interactions withSecYEG and other proteinaceous moieties. Furthermore, PBD position seems to affectthe activation of SecA. However, PBD swiveling is not the mechanical event thatpushes preproteins through SecYEG.An additional mechanism SecA uses to control its activation is its oligomerizationduring preprotein secretion. SecA interacts with SecYEG and preproteins and getsactivated as a dimer. However, SecA must monomerize to proceed to the later steps ofthe reactions and complete the threading of the preprotein through the SecYEG pore.
περισσότερα