Μελέτη των μηχανισμών δράσης των νεότερων αντιπρωτεϊνουρικών θεραπειών στη διαβητική νεφροπάθεια

Abstract

INTRODUCTION.Diabetic nephropathy is the major cause of end –stage renal disease in the Western world.In diabetic nephropathy, despite the suppression of systemic renin angiotensin system (RAS), the renal RAS is activated causing detrimental effects in the kidney. Furthermore, the glomerulus and the podocytes have a central role in the pathophysiology of diabetic nephropathy.Evidence from cell culture systems link angiotensin II and increased mTOR activity. PI3K- AKT- mTOR pathway is activated and involved in the pathogenesis of diabetic nephropathy, mediating pathologic changes. The aim was to investigate the effects of losartan on the PI3K-AKT-mTOR pathway in an animal model of type 1 diabetic nephropathy, along with clinical parameters and pathologic findings.METHODS.Diabetes mellitus was induced to Sprague-Dawley rats by streptozotocin. Monthly, the animals were put in metabolic cages for 24h urine collection and measurement of albumin excretion. Five months later, daily per os administration of losartan commenced and the rats were divided in four study groups(diabetic animals, diabetic animals on losartan, healthy animals and healthy animals on losartan). Two months later, before sacrifice, the animals were housed in metabolic cages for 24h urine collection and measurement of albumin excretion. Measurements of the animals’ blood pressure also took place before they were euthanized. Glomeruli were isolated for Western blot analysis and estimation of expression of total AKT (tAKT), phosphorylated (p)/activated forms of AKT (pAKTSer473,pAKTThre308) and nephrin. Τhe glomerular and podocytic content of tAKT,pAKT308, pAKT473, mTOR and activated mTOR phosphorylated at Ser2448 (pTOR2448) was estimated by indirect immunofluorescence.Mesangial matrix expansion was evaluated and the glomerular basement membrane width was measured.RESULTS.Diabetes mellitus increased 24h urinary albumin excretion. Losartan decreased urinary albumin excretion in diabetic animals. Diabetes mellitus caused an increase in systolic blood pressure. However, losartan did not cause any effect on blood pressure of diabetic animals.As a result of diabetes, the glomerular basement membrane width increased. This effect was reversed by losartan.Mesangium was expanded in diabetic animals with losartan showing a tendency towards reduction without statistical significance.Diabetes increased glomerular pAKT308, mTOR, and pTOR2448 protein content.In losartan treated diabetic animals, glomeruli had decreased mTOR, pTOR2448, pAKT308 and pAKT473 but increased tAKT protein levels. In podocytes, diabetes mellitus caused an increase in tAKT, pAKT308, and pTOR2448. In diabetic animals, losartan administration, despite the increase in podocytic mTOR, decreased its activation as shown by decreased pTOR2448 levels. In losartan- treated healthy animals, podocytic pTOR2448 levels were increased.Immunofluorescence results were further confirmed by Western blot.CONCLUSIONS.There was a differential pattern of activation of the PI3K-AKT-mTOR pathway in glomeruli and podocytes as a result of diabetes and losartan. Losartan influences its components in a beneficial way, implying a crosstalk between the Renin Angiotensin System and the PI3K-AKT-mTOR pathway.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ.Η διαβητική νεφροπάθεια είναι κύρια αιτία νεφρικής νόσου τελικού σταδίου στο Δυτικό κόσμο.Το Σύστημα Ρενίνης Αγγειοτασίνης (ΣΡΑ) διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην παθοφυσιολογία της διαβητικής νεφροπάθειας.Συγκεκριμένα, το συστηματικό ΣΡΑ είναι κατεσταλμένο ενώ το ενδονεφρικό είναι ενεργοποιημένο και εμπλέκεται στην παθογένεση της νεφρικής βλάβης. Tο σπείραμα και συγκεκριμένα το ποδοκύτταρο κατέχουν κεντρική θέση στην παθοφυσιολογία της διαβητικής νεφροπάθειας. Δεδομένα από κυτταροκαλλιέργειες, συνδέουν την αγγειοτασίνη II με αυξημένη δραστηριότητα mTOR.Το μονοπάτι PI3K- AKT- mTOR εμπλέκεται στην ανάπτυξη νεφρικής βλάβης στο σακχαρώδη διαβήτη.Μελετήθηκε η επίδραση της αντιπρωτεϊνουρικής θεραπείας λοσαρτάνης στο σηματοδοτικό μονοπάτι PI3K- AKT- mTOR σε in vivo μοντέλο διαβητικής νεφροπάθειας τύπου Ι, σε συνδυασμό με κλινικά και παθολογοανατομικά δεδομένα.ΜΕΘΟΔΟΙ.Αρουραίοι Sprague-Dawley έγιναν διαβητικοί με στρεπτοζοτοκίνη. Μια φορά το μήνα, διενεργείτο συλλογή ούρων 24ώρου για τη μέτρηση της λευκωματίνης.Πέντε μήνες μετά την επαγωγή του σακχαρώδους διαβήτη, ξεκίνησε η καθημερινή per os χορήγηση λοσαρτάνης και τα πειραματόζωα χωρίσθηκαν σε 4 ομάδες: διαβητικά, διαβητικά υπό λοσαρτάνη, υγιή και υγιή υπό λοσαρτάνη.Δύο μήνες μετά, προτού διενεργηθεί ευθανασία, έγινε μέτρηση της συστολικής πίεσης και συλλογή ούρων 24ώρου για τη μέτρηση της λευκωματίνης. Απομονώθηκαν σπειράματα και με Western blot εξετάσθηκε η έκφραση της ολικής AKT (tAKT), των φωσφορυλιωμένων/ ενεργοποιημένων μορφών της ΑΚΤ (pAKTSer473,pAKTThre308) και της νεφρίνης.Σε σπειράματα και ποδοκύτταρα εκτιμήθηκε η έκφραση των: tAKT,pAKT308,pAKT473,mTOR,pTOR2448 (φωσφορυλιωμένη/ ενεργοποιημένη mTOR στη Ser2448) με έμμεσο ανοσοφθορισμό.Εκτιμήθηκε η έκταση του μεσαγγείου και μετρήθηκε το πάχος της βασικής μεμβράνης του σπειράματος.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ.Η απέκκριση της λευκωματίνης ανά 24ωρο, σταδιακά αυξήθηκε στα ούρα των διαβητικών πειραματοζώων και μειώθηκε λόγω της λοσαρτάνης.Η λοσαρτάνη δεν είχε καμία επίδραση στην προκαλούμενη από το σακχαρώδη διαβήτη αύξηση της συστολικής αρτηριακής πίεσης.Παρατηρήθηκε αύξηση της έκτασης του μεσαγγείου, στα διαβητικά πειραματόζωα.Λόγω της χορήγησης λοσαρτάνης, στα διαβητικά πειραματόζωα, διαπιστώθηκε τάση για μείωση της έκτασης του μεσαγγείου χωρίς στατιστική σημαντικότητα.Η λοσαρτάνη μείωσε την προκαλούμενη από το σακχαρώδη διαβήτη πάχυνση της βασικής μεμβράνης του σπειράματος.Στα σπειράματα, ο σακχαρώδης διαβήτης προκάλεσε αύξηση των pAKT308, mTOR και pTOR2448.Η χορήγηση λοσαρτάνης στα διαβητικά πειραματόζωα προκάλεσε μείωση της mTOR, pTOR2448 και των pAKT308 και pAKT473, ενώ αύξησε τα επίπεδα της tAKT.Στα ποδοκύτταρα, ο σακχαρώδης διαβήτης προκάλεσε αύξηση στην tAKT, pAKT308 και pTOR2448.Η λοσαρτάνη στα διαβητικά πειραματόζωα, μείωσε την pTOR2448, ενώ στα ποδοκύτταρα των υγιών πειραματοζώων προκάλεσε αύξηση της pTOR2448.Τα αποτελέσματα της Western blot επιβεβαίωσαν αυτά του ανοσοφθορισμού.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ.Διαπιστώθηκε διαφορετική ρύθμιση της ενεργοποίησης του PI3K- AKT- mTOR σε σπειράματα και ποδοκύτταρα ως συνέπεια του σακχαρώδους διαβήτη και της λοσαρτάνης.Η λοσαρτάνη επηρεάζει τα επίπεδα των πρωτεϊνών του με ευεργετικό τρόπο, υποδηλώνοντας διασταυρούμενη επικοινωνία μεταξύ του ΣΡΑ και του PI3K- AKT- mTOR.