Experimental study of pregnancy toxaemia in ewes and its association with mastitis in the post - partum period

Abstract

Specific objectives of the present thesis were as follows: (i) the development of a valid model for studying pregnancy toxaemia, whilst maintaining appropriate satiation requirements in the experimental animals, (ii) the recording, by means of ultrasonographic examination, of changes occurring in the foetus and in the udder of ewes with pregnancy toxaemia, (iii) the evaluation of consequences of pregnancy toxaemia in affected ewes around the lambing period and (iv) the evaluation of the potential predisposing role of pregnancy toxaemia in development of mastitis in the immediately post-partum period.The thesis is divided into two chapters followed by the General Discussion.In Chapter Ι, the literature regarding pregnancy toxaemia is reviewed.In the Chapter II, the research work performed is described in detail. The chapter is subdivided into two sections.Section A of the chapter describes work performed and relevant results until challenge of the mammary gland of the experimental animals, which took place on the 5th day after lambing. In total, 28 ewes were included into the study. These initially had received effective anthelmintic treatment and, then, received a mixture of trichostrongylid infective larvae. Until the 60th day of pregnancy, per ewe daily ration was 1.30 kg of a concentrate feed (net energy: 0.844 FUL) plus 2.50 kg of alfalfa hay. From the 60th to 100th day of pregnancy, per ewe daily ration was 0.60 kg of the same concentrate plus 2.00 kg of hay. From the 100th day of pregnancy, per ewe daily ration was 0.50 kg of a reduced energy concentrate feed (net energy: 0.748 FUL) plus 0.50 kg of alfalfa hay for ewes with one foetus; during that period, respective figures for ewes with two foetuses were 0.60 kg and 0.50 kg and for ewes with three foetuses were 0.80 kg and 0.50 kg. In the experimental ewes, examinations performed, starting on the 120th day of pregnancy and until parturition, were: parasitological examinations of faecal samples, biochemical examination of blood samples for measurement of β-hydroxybutyrate and glucose concentrations, B-mode and Doppler ultrasonographic examinations of the foetus(es) and of the udder; examinations performed after lambing and until the 5th day after that were: weighing of lambs, examination of the genital tract of ewes and milk yield measurements of the ewes. In 16 ewes, increased β-hydroxybutyrate blood concentrations (≥1.2 mmol L-1 in at least two samplings) were detected and these animals were allocated into group A; the 12 ewes that did not, were allocated into group B. Ewes into group A had greater faecal epg counts and smaller blood concentrations of glucose than ewes into group B (P<0.025, P=0.033, respectively). There were no differences between ewes of the two groups (A, B) in findings of ultrasonographic examination of foetus(es), except for the blood input into the umbilical artery; in that parametre, values in ewes of group B were significantly greater than values in group A animals. However, there was clear evidence that when ewes were re-allocated into ones which developed and ones which did not develop dystocia, there were significant differences (P<0.047) between them in all haemodynamic parametres in the umbilical artery on the 140th and the 145th day of pregnancy. Grey-scale intensity values of mammary parenchyma of ewes in group A were significantly greater than of those of ewes in group B (P=0.007); blood input into the mammary gland was significantly greater in ewes of group B than in ewes of group A (P<0.05) and differences between the two groups were also identified in pulsatility index and in mean blood velocity (P=0.007, P=0.036, respectively) during the last fortnight of pregnancy. Mean duration of pregnancy was significantly shorter in group A ewes (145.75 days) than in group B ones (148.42 days) (P<0.001). There was also a significantly higher incidence risk of peri-parturient problems in group A ewes; incidence risks of dystocia, of perinatal mortality of offspring and of post-partum genital disorders were 0.500, 0.375 and 0.250 in group A and 0.083, 0.083 and 0.000 in group B ewes, respectively (P=0.01, P=0.039 and P=0.031, respectively). Median bodyweight of lambs of ewes allocated into group A was 3.5 kg and that of ewes into group B 4.0 kg (P=0.016); there was a significant reverse correlation between blood β-hydroxybutyrate concentrations and lamb birth bodyweight and between nematode epg faecal counts and lamb birth bodyweight (P=0.016 and P=0.03, respectively).Section B of the chapter describes work performed and relevant results after challenge of the mammary gland of the experimental animals. Group A ewes were allocated into subgroups A1 (n=8) or A2 (n=8) and group B ewes into B1 (n=8) or B2 (n=4). Ewes in A1 or B1 were challenged, on the 5th day after lambing, by deposition of Mannheimia haemolytica into one teat duct, whilst ewes in A2 and B2 were controls. Clinical and ultrasonographic examination of the udder and bacteriological and cytological examinations of the mammary secretion were performed, as well as pathological examination of the inoculated teat (after mammilectomy) and of both mammary parenchymas (after biopsy). Mastitis developed in 8/8 ewes of subgroup A1, in 1/8 ewe of subgroup A2, in 4/8 ewes in subgroup B1 and in 0/4 ewes in subgroup B2. Comparisons between subgroups revealed that isolations from A1 or A2 were greater than respective isolations from B1 or B2 (for A1 versus B1, P<0.08; for A2 versus B2, P>0.3). Also, bacteria were recovered more frequently from tissue samples from A1 than from B1 (P=0.008) and from A2 than from B2 (P=0.058). After challenge, the duct cistern and the gland cistern were observed as anechoic cavities, with presence of hyperechoic particles therein; progressively also, the ultrasonographic pattern observed in the parenchyma became markedly heterogeneous, with presence of characteristically coarse formations within. After challenge, there was clear evidence for an increase in the diametre of the external pudendal artery already 6 h after challenge. There was also an abrupt and excessive increase in blood input into the mammary parenchyma of the challenged side (for differences between A1 and B1, P<0.06); mean velocity of blood also increased immediately after challenge; finally, blood input into the teat increased immediately after challenge. The characteristic lymphoid follicles at the border between teat duct and teat cistern were observed in 3/8 ewes in A1 and in 7/8 ewes in B1 (P=0.019). In A1, cumulative score for macroscopic and histological findings in the teat was 18 and 23, respectively; cumulative score for histological findings in the mammary parenchyma ipsilateral to the inoculated teat was 24, whilst scores for A2 were 2, 9 and 5, for B1 were 5, 31 and 16 (P≤0.05 compared to results in A1) and for B2 were always 0 (P>0.05, compared to results in A2).The conclusions from the results of the present thesis are summarised herebelow.(a) A model has been developed to induce pregnancy toxaemia in ewes for use in experimental studies, at the same time covering satiation requirements of the animals. Parasitism might have further contributed to improving efficacy of the model.(b) Ultrasonographic examination of foetuses of ewes with pregnancy toxaemia revealed reduced blood input in the umbilical artery. There was a particularly intense modification of haemodynamic properties in ewes which later developed dystocia.(c) Ultrasonographic appearance of the mammary gland of ewes during lactogenesis has been described. Results of B-mode ultrasonographic examination indicated differences between healthy ewes and ewes with pregnancy toxaemia in the development of mammary parenchyma. Smaller blood input into the udder of ewes with pregnancy toxaemia was evident.(d) Increased incidence of peri-parturient problems was recorded in ewes with pregnancy toxaemia; there was also increased perinatal mortality in their offspring.(e) Pregnancy toxaemia can act as a potential predisposing factor for mastitis in the immediately post-partum period. Possibly, impairment of the lymphoid follicular structures present at the border between teat duct – teat cistern could have been the cause of reduced protection of the mammary gland.

Η παρούσα διατριβή εστιάζεται: (α) στην ανάπτυξη ενός έγκυρου προτύπου για τη μελέτη της τοξιναιμίας της εγκυμοσύνης, με ταυτόχρονη διατήρηση των απαιτήσεων κορεσμού των ζώων, (β) στην καταγραφή, με υπερηχογραφική εξέταση, των μεταβολών στο έμβρυο και στο μαστό των προβατίνων με τοξιναιμία της εγκυμοσύνης, (γ) στην αξιολόγηση των συνεπειών της τοξιναιμίας της εγκυμοσύνης στις προσβεβλημένες προβατίνες κατά την περιτοκετιαία περίοδο και (δ) στην αξιολόγηση του ενδεχόμενου ρόλου της τοξιναιμίας της εγκυμοσύνης σε προδιάθεση των ζώων σε μαστίτιδα κατά την αμέσως μετά τον τοκετό περίοδο.Η διατριβή χωρίζεται σε δύο κεφάλαια και ακολουθεί η Γενική Συζήτηση.Στο Κεφάλαιο I ανασκοπείται η βιβλιογραφία σχετικά με την τοξιναιμία της εγκυμοσύνης.Στο Κεφάλαιο II παρουσιάζεται η πραγματοποιηθείσα ερευνητική μελέτη. Το κεφάλαιο υποδιαρείται σε δύο τμήματα.Το τμήμα Α του κεφαλαίου περιγράφει την ερευνητική μελέτη και τα σχετικά αποτελέσματα μέχρι τον ενοφθαλμισμό του μαστού των ζώων, ο οποίος πραγματοποιήθηκε την 5η ημέρα μετά τον τοκετό. Στη μελέτη περιλήφθησαν 28 προβατίνες. Αρχικά, στα ζώα πραγματοποιήθηκε ανθελμινθική αγωγή και, στη συνέχεια, αυτά έλαβαν ένα μίγμα από μολύνουσες προνύμφες τριχοστρογγυλοειδών ελμίνθων. Μέχρι την 60ή ημέρα της εγκυμοσύνης, σε κάθε προβατίνα χορηγείτο καθημερινά 1,30 kg έτοιμης συμπυκνωμένης ζωοτροφής (περιεκτικότητα σε ενέργεια: 0,844 FUL) και 2,50 kg σανού τριφυλλιού. Από την 60ή μέχρι την 100ή ημέρα της εγκυμοσύνης, κάθε προβατίνα ελάμβανε καθημερινά 0,60 kg συμπυκνωμένης ζωοτροφής και 2,00 σανού τριφυλλιού. Μετά την 100ή ημέρα της εγκυμοσύνης, κάθε προβατίνα που κυοφορούσε ένα έμβρυο ελάμβανε καθημερινά 0,50 kg έτοιμης συμπυκνωμένης ζωοτροφής με μειωμένη περιεκτικότητα σε ενέργεια (0,748 FUL) και 0,50 kg σανού τριφυλλιού. Οι αντίστοιχες ποσότητες για προβατίνες που κυοφορούσαν δύο έμβρυα ήταν 0,60 kg και 0,50 kg, αντίστοιχα, και για προβατίνες που κυοφορούσαν τρία έμβρυα ήταν 0,80 kg και 0,50 kg, αντίστοιχα. Στις προβατίνες πραγματοποιούνταν οι παρακάτω εξετάσεις από την 120ή ημέρα της εγκυμοσύνης μέχρι τον τοκετό: παρασιτολογική εξέταση κοπράνων, βιοχημική εξέταση αίματος για μέτρηση της συγκέντρωσης β-υδροξυβουτυρικού οξέος και γλυκόζης, υπερηχογραφική εξέταση B-mode και Doppler εμβρύου/ων και μαστού. Από τον τοκετό μέχρι την 5η ημέρα μετά από αυτόν, πραγματοποιούνταν οι παρακάτω εξετάσεις: ζύγισμα των νεογέννητων αρνιών, εξέταση του γεννητικού συστήματος και μέτρηση της παραγόμενης ποσότητας γάλακτος. Σε 16 προβατίνες παρατηρήθηκαν αυξημένες συγκεντρώσεις β-υδροξυβουτυρικού οξέος στο αίμα (≥1,2 mmol L-1 σε τουλάχιστον δύο μετρήσεις) και αυτά τα ζώα κατανεμήθηκαν στην ομάδα Α, ενώ στις υπόλοιπες 12 προβατίνες δεν παρατηρήθηκαν αυξημένες συγκεντρώσεις β-υδροξυβουτυρικού οξέος στο αίμα και κατανεμήθηκαν στην ομάδα Β. Οι προβατίνες στην ομάδα Α είχαν αυξημένο αριθμό αυγών παρασίτων (epg) στα κόπρανα και μικρότερες συγκεντρώσεις γλυκόζης στο αίμα από αυτές στην ομάδα Β (P<0,025, P=0,033, αντίστοιχα). Δεν υπήρχαν διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων (A, B) στα ευρήματα της υπερηχογραφικής εξέτασης των εμβρύων, εκτός από τον όγκο αίματος στην ομφαλική αρτηρία, παράμετρο για την οποία οι τιμές στα ζώα της ομάδας Β ήταν σημαντικά μεγαλύτερες από τις αντίστοιχες τιμές στα ζώα της ομάδας Α. Μολαταύτα, όταν πραγματοποιήθηκε ανακατανομή των ζώων σε προβατίνες οι οποίες εκδήλωσαν δυστοκία και σε προβατίνες οι οποίες δεν εκδήλωσαν δυστοκία, παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές (P<0,047) μεταξύ των δύο κατηγοριών σε όλες τις αιμοδυναμικές παραμέτρους στην ομφαλική αρτηρία την 140ή και την 145η ημέρα της εγκυμοσύνης. Οι τιμές της έντασης των τόνων φωτεινότητας του γκρι χρώματος στο μαστικό παρέγχυμα ήταν μεγαλύτερη στα ζώα της ομάδας Α από τα ζώα της ομάδας Β (P=0,007). Ο όγκος αίματος στον μαστικό αδένα ήταν μικρότερος στα ζώα της ομάδας Α απ’ ό,τι στα ζώα της ομάδας Β (P<0,05) και επιπλέον παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων στο δείκτη παλμικότητας και στη μέση ταχύτητα του αίματος (P=0,007, P=0,036, αντίστοιχα) κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων εβδομάδων της εγκυμοσύνης. Η μέση διάρκεια της εγκυμοσύνης ήταν σημαντικά μικρότερης διάρκειας στις προβατίνες της ομάδας Α (145,75 ημέρες) απ’ ό,τι στις προβατίνες της ομάδας Β (148,42 ημέρες) (P<0,001). Παρατηρήθηκε επίσης μεγαλύτερο ποσοστό προσβολής από περιτοκετιαία προβλήματα στα ζώα της ομάδας Α. Ειδικότερα, το ποσοστό προσβολής από δυστοκία, περιγεννητικό θάνατο των εμβρύων/νεογέννητων ή επιλόχειες παθολογικές καταστάσεις του γεννητικού συστήματος ήταν 0,500, 0,375 ή 0,250, αντίστοιχα, στα ζώα της ομάδας Α, ενώ στα ζώα της ομάδας Β ήταν 0,083, 0,083 ή 0,000, αντίστοιχα (P=0,01, P=0,039 ή P=0,031, αντίστοιχα). Το μέσο σωματικό βάρος των νεογέννητων αρνιών από προβατίνες στην ομάδα Α ήταν 3,5 kg και αυτό των αρνιών από προβατίνες στην ομάδα Β ήταν 4,0 kg (P=0,016). Βρέθηκε ότι υπήρχε σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ των συγκεντρώσεων του β-υδροξυβουτυρικού οξέος στο αίμα των έγκυων προβατίνων και του σωματικού βάρους των νεογέννητων αρνιών, καθώς και μεταξύ του παρασιτικού φορτίου των έγκυων προβατίνων και του σωματικού βάρους των νεογέννητων αρνιών (P=0,016 και P=0,03, αντίστοιχα).Το τμήμα Β του κεφαλαίου περιγράφει την ερευνητική μελέτη και τα σχετικά αποτελέσματα μετά τον ενοφθαλμισμό του μαστού των ζώων, ο οποίος πραγματοποιήθηκε την 5η ημέρα μετά τον τοκετό. Οι προβατίνες στην ομάδα Α χωρίστηκαν στις υποομάδες Α1 (n=8) και Α2 (n=8) και αυτές στην ομάδα Β στις υποομάδες Β1 (n=8) και Β2 (n=4). Τα ζώα στις υποομάδες Α1 και Β1 ενοφθαλμίστηκαν την 5η ημέρα μετά τον τοκετό με εναπόθεση Mannheimia haemolytica στο θηλαίο πόρο, ενώ αυτά στις υποομάδες Α2 και Β2 ήταν μάρτυρες. Πραγματοποιήθηκαν κλινική και υπερηχογραφική εξέταση B-mode και Doppler του μαστού και βακτηριολογική και κυτταρολογική εξέταση του μαστικού εκκρίματος, καθώς και ιστολογική εξέταση της ενοφθαλμισμένης θηλής (μετά από θηλεκτομή) και του παρεγχύματος των δύο μαστικών αδένων (μετά από λήψη ιστοτεμαχίου με βιοψία). Μαστίτιδα εκδηλώθηκε σε όλες (8/8) τις προβατίνες της υποομάδας Α1, σε 1/8 προβατίνα της υποομάδας Α2, σε 4/8 προβατίνες της υποομάδας Β1 και σε 0/4 προβατίνες της υποομάδας Β2. Η συχνότητα απομόνωσης M. haemolytica από ζώα των υποομάδων Α1 ή Α2 ήταν μεγαλύτερη από την αντίστοιχη από ζώα των υποομάδων Β1 ή Β2 (A1 έναντι B1: P<0,08, A2 έναντι Β2: P>0,3). Επίσης, M. haemolytica απομονώθηκε συχνότερα από δείγματα ιστών ζώων των υποομάδων Α1 (Α1 έναντι Β1: P=0,008) και Α2 (Α2 έναντι Β2: P=0,058). Μετά τον ενοφθαλμισμό, ο θηλαίος κόλπος και ο γαλακτοφόρος κόλπος απεικονίζονταν ως ανηχογενείς κοιλότητες, με παρουσία υπερηχογενών σωματιδίων εντός αυτών. Η υπερηχογραφική εικόνα εντός του παρεγχύματος προοδευτικά παρουσίαζε ανομοιογένεια και αδρούς σχηματισμούς. Η διάμετρος της μαστικής αρτηρίας αυξήθηκε σημαντικά ήδη έξι ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό, οπότε παρατηρήθηκε επίσης απότομη και σημαντική αύξηση στον όγκο αίματος στη μαστική αρτηρία στην ενοφθαλμισμένη πλευρά του μαστού (A1 έναντι B1: P<0,06), καθώς και στη μέση ταχύτητα του αίματος στο αγγείο. Επίσης, παρατηρήθηκε αύξηση στον όγκο αίματος στις ενοφθαλμισμένες θηλές. Οι χαρακτηριστικοί λεμφοειδείς σχηματισμοί στο όριο μεταξύ θηλαίου πόρου και θηλαίου κόλπου παρατηρήθηκαν σε 3/8 προβατίνες στην υποομάδα Α1 και σε 7/8 στην υποομάδα Β1 (P=0,019). Στην υποομάδα Α1, οι σωρευτικές τιμές για τα μακροσκοπικά και ιστολογικά ευρήματα στη θηλή ήταν 18 και 23, αντίστοιχα και η σωρευτική τιμή για τα ιστολογικά ευρήματα στο μαστικό παρέγχυμα της ενοφθαλμισμένης πλευράς ήταν 24. Οι αντίστοιχες τιμές για την υποομάδα Α2 ήταν 2, 9 και 5, για την υποομάδα B1 ήταν 5, 31 και 16 (P≤0.05 έναντι της υποομάδας Α1) και για την υποομάδα Β2 όλες οι τιμές ήταν 0 (P>0.05 έναντι της υποομάδας Α2).Τα συμπεράσματα που προκύπτουν από τα ευρήματα αυτής της διατριβής είναι τα παρακάτω.(α) Αναπτύχθηκε πρότυπο για πρόκληση τοξιναιμίας της εγκυμοσύνης σε προβατίνες για εφαρμογή σε πειραματικές μελέτες. Με το εν λόγω πρότυπο, καλύπτονταν οι απαιτήσεις κορεσμού των ζώων. Ο παρασιτισμός των ζώων ενδεχομένως συνέβαλε στην αποτελεσματική ανάπτυξη του προτύπου.(β) Η υπερηχογραφική εξέταση των εμβρύων των προβατίνων με τοξιναιμία της εγκυμοσύνης έδειξε μειωμένο όγκο αίματος στην ομφαλική αρτηρία. Παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στις αιμοδυναμικές ιδιότητες, ειδικά δε σε προβατίνες στις οποίες εκδηλώθηκε δυστοκία.(γ) Περιγράφηκε η υπερηχογραφική εικόνα των μαστικών αδένων των προβατίνων κατά τη διάρκεια της γαλακτογένεσης. Τα ευρήματα της υπερηχογραφικής εξέτασης B-mode έδειξαν διαφορές μεταξύ υγιών προβατίνων και προβατίνων με τοξιναιμία της εγκυμοσύνης στην ανάπτυξη του μαστικού παρεγχύματος. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μικρότερος όγκος αίματος στο μαστό προβατίνων με τοξιναιμία της εγκυμοσύνης.(δ) Παρατηρήθηκε αυξημένο ποσοστό προσβολής από περιτοκετιαία προβλήματα σε προβατίνες με τοξιναιμία της εγκυμοσύνης, καθώς και αυξημένη συχνότητα περιστατικών περιγεννητικής θνησιμότητας στα έμβρυα/νεογνά αυτών των προβατίνων.(ε) Η τοξιναιμία της εγκυμοσύνης αποτελεί παράγοντα προδιάθεσης για μαστίτιδα στην επιλόχεια περίοδο. Πιθανόν, η μειωμένη λειτουργικότητα των λεμφοθυλακίων στο όριο θηλαίου πόρου-θηλαίου κόλπου να οδηγεί σε μειωμένη προστασία του μαστικού αδένα.