Μελέτη μονοπατιών μεταγωγής σήματος που ενεργοποιούνται από τον αυξητικό παράγοντα πλειοτροπίνη και επηρεάζουν την κυτταρική μετανάστευση

Abstract

Accumulating evidence suggests that growth factors, such as VEGF, FGF2 and PDGF, involved in angiogenesis are regulated by low levels of endogenous ROS. Pleiotrophin (PTN), also known as heparin affin regulatory peptide, is an 18kDa growth factor that has high affinity for heparin. A great body of evidence indicates that PTN is involved in the control of cellular proliferation, migration and differentiation and plays a significant role in tumour growth and angiogenesis. The stimulatory effect of PTN on cell migration requires both receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) and ανβ3 integrin on the cell membrane. We have previously shown that PTN through RPTPβ/ζ stimulates intracellular ROS production in a dose- and time-dependent manner in HUVEC and intracellular ROS increase is required for PTN-induced cell migration. In this doctorate thesis, PTN-induced ROS production in HUVEC was found to depend on ανβ3 expression and phosphorylation of β3 at Tyr773. PTN-induced ROS production and cell migration is mediated by xanthine oxidase (XO), which lies downstream of c-src, PI3K and ERK1/2. Since ανβ3 integrin determines the stimulatory effect of PTN on cell migration, we searched for proteins that are involved in cell migration and interact with ανβ3, e.g. proteins having the FERM domain, which may participate in PTN’s signaling pathway. Preliminary observations pointed to the ERM protein moesin, which is known to play a significant role in cell motility by linking the actin cytoskeleton to a variety of membrane-anchoring proteins, may have a role in PTN actions. In the present thesis, it is for the first time reported that moesin directly interacts with ανβ3 and is involved in PTN- induced human endothelial cell migration, but not ROS production. By using immunoprecipitation/Western blot analyses, double immune-fluorescence and proximity ligation assays, it was shown that moesin is located at the plasma membrane and the cytoplasm, is exposed extracellularly and in some types of cells it was found in the nucleus. Co-localization of moesin with ανβ3 was observed at the cell membrane and was decreased after cell stimulation with PTN. Moesin directly interacts with PTN and their co-localization was also observed at the cell membrane. Finally, it was found that PTN transiently stimulates Thr558 phoshorylation of moesin, in a time-dependent manner, with the maximum effect observed 10 min after PTN treatment. PTN-induced moesin phosphorylation takes place downstream of c-Src, PI3K and CDK5 and seems to be independent of ERK1/2 activation. Furthermore, PTN- induced moesin phosphorylation seems to depend on Rac 1 and is inhibited by CS-E administration. It remains unclear if Thr558 moesin phosphorylation is related to PTN-induced cell migration or other PTN functions. Collectively, involvement of XO and moesin in PTN-mediated endothelial cell functions is reported for the first time in the literature and is expected to contribute to the elucidation of the actions, as well as the signaling pathways involved in the regulation of angiogenesis by PTN. Such knowledge could significantly contribute in the long term, to the design of novel therapeutic strategies to control angiogenesis.

Τα τελευταία χρόνια αναγνωρίζεται όλο και περισσότερο ότι αυξητικοί παράγοντες που εμπλέκονται στη διαδικασία της αγγειογένεσης, όπως ο VEGF, ο FGF2 και ο PDGF ασκούν την επαγωγική δράση τους μέσω παραγωγής δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Η πλειοτροπίνη (Pleiotrophin, PTN) είναι ένας αυξητικός παράγοντας, έχει μοριακή μάζα 18 kDa, παρουσιάζει υψηλή συγγένεια με την ηπαρίνη, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος και η δράση της σχετίζεται με αγγειογένεση και καρκινική ανάπτυξη. Για την επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση των κυττάρων είναι απαραίτητη η έκφραση τόσο του υποδοχέα RPTPβ/ζ, όσο και της ιντεγκρίνης ανβ3 στην κυτταρική μεμβράνη. Η ερευνητική μας ομάδα έχει δείξει σε προηγούμενη μελέτη ότι η PTN μέσω του RPTPβ/ζ αυξάνει με δοσοεξαρτώμενο και χρονοεξαρτώμενο τρόπο τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC, γεγονός που φαίνεται να σχετίζεται με την επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση των κυττάρων. Στην παρούσα διατριβή βρέθηκε ότι η επαγόμενη από την ΡΤΝ παραγωγή ROS στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC εξαρτάται και από την έκφραση της ιντεγκρίνης β3 και την τυροσίνη της θέσης 773 της β3. Η επαγόμενη από ΡΤΝ παραγωγή ROS και κυτταρική μετανάστευση φαίνεται να διαμεσολαβείται από την οξειδάση της ξανθίνης (XO), η οποία βρίσκεται καθοδικά των κινασών c-src, PI3K και ERK1/2. Aρχικές παρατηρήσεις της ερευνητικής μας ομάδας έδειξαν ότι η πρωτεΐνη moesin, η οποία είναι γνωστό ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση, ελέγχοντας την αλληλεπίδραση της ακτίνης του κυτταροσκελετού με μεμβρανικές πρωτεΐνες, ίσως να εμπλέκεται στις δράσεις της ΡΤΝ. Στην παρούσα διατριβή βρέθηκε για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία ότι η moesin αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη ανβ3 και να εμπλέκεται στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση, αλλά όχι στην παραγωγή ROS. Επιπλέον, με τη χρήση μεθόδων ανοσοκατακρήμνισης-ανοσοαποτυπώματος, διπλού ανοσοφθορισμού και προσδιορισμού αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας βρέθηκε ότι η πρωτεΐνη moesin εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη και στο κυτταρόπλασμα, εκτίθεται στην εξωκυτταρική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης, ενώ σε κάποιους τύπους κυττάρων παρατηρήθηκε και πυρηνικός εντοπισμός της. Συνεντοπισμός της moesin με την ανβ3 παρατηρείται στην κυτταρική μεμβράνη και η αλληλεπίδραση αυτή μειώνεται μετά από δέγερση των κυττάρων με ΡΤΝ. Η moesin αλληλεπιδρά άμεσα και με την ΡΤΝ και συνεντοπισμός τους επίσης παρατηρείται στην κυτταρική μεμβράνη. Τέλος, βρέθηκε ότι η ΡΤΝ προκαλεί μια χρονο-εξαρτώμενη αλλά παροδική αύξηση της φωσφορυλίωσης της moesin στη Thr558, η οποία είναι μέγιστη μέχρι τα 10 λεπτά μετά τη διέγερση με ΡΤΝ και επανέρχεται στα επίπεδα του μάρτυρα στα 15 λεπτά. H επαγόμενη από ΡΤΝ φωσφορυλίωση της moesin λαμβάνει χώρα καθοδικά των κινασών c-Src, PI3K και CDK5 και φαίνεται να είναι ανεξάρτητη της ενεργοποίησης των ERK1/2. Επιπλέον, φαίνεται να εξαρτάται από τη Rac1 και να αναστέλλεται από την εξωγενή χορήγηση CS-E. Παραμένει αδιευκρίνιστο εάν η φωσφορυλίωση της moesin στη Thr558 σχετίζεται με την επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση ή σχετίζεται με άλλες δράσεις της ΡΤΝ. Συμπερασματικά, η συμμετοχή τόσο της ΧΟ, όσο και της πρωτεΐνης moesin στις διαμεσολαβούμενες από την ΡΤΝ δράσεις των ενδοθηλιακών κυττάρων αναφέρεται για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία και αναμένεται να οδηγήσει στη διαλεύκανση των δράσεων και των μορίων μεταγωγής σήματος που εμπλέκονται στις δράσεις της ΡΤΝ στην αγγειογένεση. Κάτι τέτοιο θα συμβάλλει σημαντικά στον μακροπρόθεσμο σχεδιασμό νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για έλεγχο της αγγειογένεσης.