Ταυτοποίηση υποδοχέων και μελέτη της σχέσης δομής - δράσης στην κυτταρική μετανάστευση του αυξητικού παράγοντα πλειοτροπίνη

Abstract

Pleiotrophin is a growth factor that among other functions, plays a significant role on tumor growth and angiogenesis. Our group has previously shown that pleiotrophin is able to induce migration of endothelial cells through binding to its receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ). In the present study we show that a monoclonal antibody against ανβ3 but not α5β1 integrin abolished pleiotrophin-induced human endothelial cell migration in a concentration-dependent manner. Integrin ανβ3 was found to directly interact with pleiotrophin in an RGD-independent manner, whereas a synthetic peptide corresponding to the specificity loop of the β3 integrin extracellular domain (177CYDMKTTC184) inhibited pleiotrophin-ανβ3 interaction and totally abolished pleiotrophin-induced endothelial cell migration. Interestingly, ανβ3 was also found to directly interact with RPTPβ/ζ, and pleiotrophin-induced Y773 phosphorylation of β3 integrin was dependent on both RPTPβ/ζ and the downstream c-Src kinase activation, which furthermore interacts with β3 integrin. Midkine was found to interact with RPTPβ/ζ, but not with ανβ3, and caused a small but statistically significant decrease in cell migration. In the same line, pleiotrophin decreased migration of different glioma cell lines that express RPTPβ/ζ but do not express ανβ3, while it stimulated migration of U87MG cells that express ανβ3 on their cell membrane. Overexpression of β3 in glioma cells stimulated the effect of pleiotrophin on cell migration. In the same line, pleiotrophin had no effect on migration of CHO cells that do not express β3, while it induced proliferation of the same cells, stably transfected to over-express wild-type β3. In cells over-expressing mutant β3 with replacement of cytoplasmic tyrosines 773 and 785 to phenylalanines, PTN had no effect on migration, suggesting that PTN-induced phosphorylation of tyrosine 773 is required for PTN-induced cell migration. However, the fact that midkine also induces phosphorylation of tyrosine 773 suggests that it is not sufficient by itself to transducer the stimulatory effect of PTN. Collectively, these data suggest that ανβ3 is a key molecule that determines the stimulatory or inhibitory effect of pleiotrophin on cell migration. Furthermore, the mode of action of a synthetic peptide that corresponds to the last 26 aminoacids of the C-terminal region of pleiotrophin (S1 peptide) and has inhibitory effects on angiogenesis in vivo and on pleiotrophin-induced endothelial cell migration and tube formation in vitro was further clarified. The peptide was found to inhibit pleiotrophin binding to ανβ3 integrin whereas it did not affect pleiotrophin binding to RPTPβ/ζ in human endothelial cells. These data explain the inhibitory effects of peptide S1 on pleiotrophin-induced biological activities and clarify that the C-terminal region of pleiotrophin is the domain responsible for the interaction with ανβ3 integrin. Finally, peptide S1 can be used to develop effective molecules in inhibiting actions of pleiotrophin through integrin ανβ3, in order to be used for treating pathologies where pleiotrophin seems to have significant role.

Η πλειοτροπίνη αποτελεί έναν αυξητικό παράγοντα με ποικίλες δράσεις και σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων και την αγγειογένεση. Η ερευνητική μας ομάδα έχει δείξει σε προηγούμενη μελέτη ότι η πλειοτροπίνη επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, μέσω πρόσδεσής της στον υποδοχέα της RPTPβ/ζ. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της ιντεγκρίνης ανβ3, αλλά όχι έναντι της α5β1, ανέστειλε την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η πλειοτροπίνη βρέθηκε να αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη ανβ3 και η αλληλεπίδραση αυτή είναι ανεξάρτητη από τη θέση δέσμευσης της αλληλουχίας RGD της ιντεγκρίνης. Αντίθετα, ένα συνθετικό πεπτίδιο το οποίο αντιστοιχεί στην κυστεϊνική θηλιά (177CYDMKTTC184) στο εξωκυτταρικό τμήμα της υπομονάδας β3 ανέστειλε την αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την ιντεγκρίνη ανβ3 και την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, η ιντεγκρίνη ανβ3 βρέθηκε να αλληλεπιδρά και με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, ενώ η επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της ιντεγκρίνης β3 διαμεσολαβείται μέσω του RPTPβ/ζ και της καθοδικής αυτού κινάσης c-Src, η οποία επιπλέον αλληλεπιδρά και με την ιντεγκρίνη β3. Η midkine βρέθηκε ότι αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, αλλά όχι με την ιντεγκρίνη ανβ3, ενώ προκάλεσε μια μικρή, αλλά στατιστικά σημαντική αναστολή στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στο ίδιο πλαίσιο, η πλειοτροπίνη ανέστειλε τη μετανάστευση διαφορετικών κυτταρικών σειρών γλοιώματος τα οποία εκφράζουν τον RPTPβ/ζ, αλλά όχι την ιντεγκρίνη ανβ3­, ενώ προκάλεσε επαγωγή της μετανάστευσης στα κύτταρα U87MG, που εκφράζουν την ιντεγκρίνη ανβ3 στην κυτταρική τους μεμβράνη. Υπερέκφραση της ιντεγκρίνης β3 σε κύτταρα γλοιώματος είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγική δράση της πλειοτροπίνης στην κυτταρική μετανάστευση. Παρόμοια, η πλειοτροπίνη δεν είχε καμία δράση στη μετανάστευση κυττάρων CHO που δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη β3, ενώ προκάλεσε σημαντική επαγωγή στη μετανάστευση των ίδιων κυττάρων σταθερά διαμολυσμένων ώστε να υπερεκφράζουν την ιντεγκρίνη β3. Σε κύτταρα CHO σταθερά διαμολυσμένα ώστε να υπερεκφράζουν μία μεταλλαγμένη μορφή της ιντεγκρίνης β3, στην οποία οι τυροσίνες 773 και 785 έχουν αντικατασταθεί με φαινυλαλανίνη, η πλειοτροπίνη δεν είχε καμία δράση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 είναι απαραίτητη για τη μεταγωγή του σήματος της πλειοτροπίνης που οδηγεί σε κυτταρική μετανάστευση. Το γεγονός ότι και η midkine προκάλεσε επαγωγή της φωσφορυλίωσης της τυροσίνης 773 δείχνει επιπλέον ότι η φωσφορυλίωση αυτή από μόνη της δεν είναι ικανή να οδηγήσει σε επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η ιντεγκρίνη ανβ3 είναι ένα μόριο που καθορίζει την επαγωγική ή ανασταλτική δράση της πλειοτροπίνης στην κυτταρική μετανάστευση.