Μελέτη του ρόλου του αυξητικού παράγοντα πλειοτροπίνη και υποδοχέων της σε διαδικασίες που αφορούν στην αλληλεπίδραση καρκινικών κυττάρων προστάτη με οστεοβλάστες και στην αγγειογένεση

Abstract

Pleiotrophin (PTN) is a growth factor that appears to play an important role in prostate cancer growth and angiogenesis and may play a role in bone growth and remodeling. PTN exerts its activities through receptor with protein tyrosine phosphatase receptor zeta 1 (PTPRZ1), ανβ3 integrin, and cell membrane nucleolin. PTN also regulates the angiogenic actions of vascular endothelial growth factor A (VEGF-A); the latter is expressed by pro-osteoblasts and has autocrine and paracrine actions, inducing the proliferation, migration, and differentiation of osteoblasts, as well as bone angiogenesis. VEGF-A expression is elevated in cases of prostate cancer and is associated with osteoblastic tumor metastasis. Recent studies of our research team have shown that PTN and VEGF-A compete for binding to PTPRZ1 and PTPRZ1 appears to be involved in the effect of VEGF-A on endothelial cell migration. Based on the above, in the present thesis, the role of PTN in the proliferation, migration and differentiation of osteoblasts, as well as in the survival and the ability of prostate cancer cells to adhere to osteoblasts was studied. In addition, the interaction of PTN with VEGFR2 in endothelial cells and osteoblasts was investigated and the functional significance of this interaction was studied. PTN has been found to be expressed in Saos-2, MG-63 and MC3T3-E1 osteoblast cell lines, localized on the cell membrane, cytoplasm, and nucleus, similarly to its localization in endothelial cells. PTN causes a small decrease in osteoblast proliferation, which is statistically significant only in MC3T3-E1 pro-osteoblasts, statistically significantly decreases the migration of all osteoblast cell lines studied, while induces the differentiation of MC3T3-E1 pro-osteoblasts to mature osteoblasts. In human prostate cancer PC3 cells, a decrease in PTN expression leads to induction of apoptosis and a reduction in the adhesion of cancer cells to osteoblasts. To elucidate the PTN receptors involved in this adhesion, it was found using many different experimental approaches that PTN selectively interacts with high affinity with VEGFR2 in osteoblasts and endothelial cells. PTN appears to bind through its N-terminus site to the VEGFR2, at a site that affects VEGF-A binding, and reduces VEGFR2 phosphorylation induced by VEGF-A165. This interaction explains the inhibitory effect of PTN on osteoblast migration, but not the stimulatory effect on endothelial cells migration, which is mediated by integrin ανβ3. A neutralizing monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of VEGFR2 or silencing VEGFR2 with siRNA lead to enhanced cell migration, which is inhibited by a neutralizing antibody that inhibits integrin αvβ3 or by a PTN peptide corresponding to its carboxy terminus that also inhibits ανβ3 integrin. Finally, using peptides that correspond to different regions of the PTN protein and inhibit its interaction with different receptors, as well as using pharmacological inhibitors of different PTN receptors, it was found that membrane nucleolin is the receptor involved in the adhesion of prostate cancer cells with osteoblasts. The thesis also identified peptides that warrant further studies as potential inhibitors of angiogenesis and/or prostate cancer cell metastasis to bone.

Η πλειοτροπίνη (pleiotrophin, PTN) είναι ένας αυξητικός παράγοντας που φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη και την αγγειογένεση, ενώ έχει αναφερθεί ότι ίσως παίζει ρόλο στην ανάπτυξη και αναδιαμόρφωση των οστών. Η ΡΤΝ ασκεί τις δράσεις της μέσω του υποδοχέα με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (PTPRZ1), της ιντεγκρίνης ανβ3, και της μεμβρανικής νουκλεολίνης. Η ΡΤΝ επηρεάζει, επίσης τις δράσεις του αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου Α (vascular endothelial growth factor A, VEGF-A), ο οποίος εκφράζεται και από τους προ-οστεοβλάστες κι έχει αυτοκρινείς και παρακρινείς δράσεις, επάγοντας τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών, και διεγείροντας την αγγειογένεση στα οστά. Η έκφραση του VEGF-Α είναι αυξημένη σε περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη και σχετίζεται με την οστεοβλαστικού τύπου μετάσταση των όγκων. Πρόσφατες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας έδειξαν ότι ΡΤΝ και VEGF-A ανταγωνίζονται για δέσμευση στον PTPRZ1 και ο PTPRZ1 φαίνεται να εμπλέκεται σε σημαντικές αγγειογενετικές δράσεις του VEGF-A, όπως είναι η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Με βάση τα παραπάνω, στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε ο ρόλος της ΡΤΝ στον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση οστεοβλαστών, καθώς και στην επιβίωση και την ικανότητα προσκόλλησης των καρκινικών κυττάρων προστάτη σε οστεοβλάστες. Επιπλέον, διερευνήθηκε η αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τον VEGFR2 σε ενδοθηλιακά κύτταρα και οστεοβλάστες και μελετήθηκε η λειτουργική σημασία της αλληλεπίδρασης αυτής. Βρέθηκε ότι η ΡΤΝ εκφράζεται στους οστεοβλάστες (χρησιμοποιήθηκαν οι κυτταρικές σειρές Saos-2, MG-63 και MC3T3-E1) και εντοπίζεται στη μεμβράνη, στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα τους, παρόμοια με τον εντοπισμό της στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η ΡΤΝ προκαλεί μια μικρή μείωση του πολλαπλασιασμού των οστεοβλαστών, η οποία είναι στατιστικά σημαντική μόνο στους προ-οστεοβλάστες MC3T3-E1, και μειώνει στατιστικά σημαντικά τη μετανάστευση όλων των κυτταρικών σειρών οστεοβλαστών που μελετήθηκαν, ενώ επάγει τη διαφοροποίηση των προ-οστεοβλαστών MC3T3-E1 σε ώριμους οστεοβλάστες. Στα καρκινικά κύτταρα προστάτη PC3, μείωση της έκφρασης της ΡΤΝ οδηγεί σε επαγωγή της απόπτωσης και μείωση της προσκόλλησης των καρκινικών κυττάρων στους οστεοβλάστες. Στην προσπάθεια διαλεύκανσης των υποδοχέων της ΡΤΝ που εμπλέκονται σε αυτήν την προσκόλληση, βρέθηκε με τη χρήση πολλών διαφορετικών πειραματικών προσεγγίσεων ότι η ΡΤΝ αλληλεπιδρά εκλεκτικά και με υψηλή χημική συγγένεια με τον VEGFR2 σε οστεοβλάστες και σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Η PΤΝ φαίνεται να δεσμεύεται μέσω της αμινοτελικής της περιοχής σε θέση του VEGFR2 που επηρεάζει τη δέσμευση του VEGF-A, και μειώνει τη φωσφορυλίωση του VEGFR2 που προκαλεί ο VEGF-A165. H δράση αυτή εξηγεί την ανασταλτική δράση της ΡΤΝ στη μετανάστευση των οστεοβλαστών, αλλά όχι την επαγωγική δράση στα ενδοθηλιακά κύτταρα, που διαμεσολαβείται από την ιντεγκρίνη ανβ3. Βρέθηκε, ότι μονοκλωνικό αντίσωμα που δεσμεύεται στην εξωκυτταρική περιοχή του VEGFR2 ή αποσιώπηση του VEGFR2 με siRNA οδηγούν σε επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης, η οποία αναστέλλεται από αντίσωμα που αναστέλλει την ιντεγκρίνη ανβ3 ή από πεπτίδιο της ΡΤΝ που αντιστοιχεί στο καρβοξυτελικό της άκρο και επίσης αναστέλλει την ιντεγκρίνη ανβ3. Τέλος, με τη χρήση πεπτιδίων που αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές του μορίου της ΡΤΝ και αναστέλλουν την αλληλεπίδρασή της με διαφορετικούς υποδοχείς, καθώς και με φαρμακολογικούς αναστολείς των διαφορετικών υποδοχέων της ΡΤΝ, βρέθηκε ότι η μεμβρανική νουκλεολίνη είναι ο υποδοχέας που εμπλέκεται σε σημαντικό βαθμό στην αλληλεπίδραση των καρκινικών κυττάρων προστάτη με οστεοβλάστες και ταυτοποιήθηκαν πεπτίδια που θα μπορούσαν να μελετηθούν και αξιοποιηθούν περαιτέρω ως αναστολείς της αγγειογένεσης και/ή της μετάστασης καρκινικών κυττάρων προστάτη στα οστά.