Μελέτη μηχανισμών δράσης του αυξητικού παράγοντα HARP σε ενδοθηλιακά κύτταρα

Abstract

One of the most important processes during the development of higher organisms is the formation of blood vessels. There are two processes by which new blood vesses are formed, vasculogenesis and angiogenesis. Vasculogenesis describes the de novo formation of blood vessels, while angiogenesis describes the development of new blood vessels from existing ones. Angiogenesis is a complex process that involves many sequential steps. In response to an angiogenic stimulus endothelial cells from existing vessels migrate and start to form a new vessel. Many growth factors are involved in this process with most notable the vascular endothelial cell growth factor, (VEGF). Another newly discovered growth factor that participates in angiogenesis is the Heparin affinity regulatory peptide (HARP), a member of the Heparin-binding growth factors family. In the present thesis we have studied the effects of HARP on the expression of the VEGF receptors at the endothelial cells BBC and HUVEC and at the modulation of VEGF’s action on these cell types. We have also studied HARP-mediated signal transduction pathways involving protein tyrosine phosphorylation and the existence on known HARP receptor molecules in HUVEC and BBC cells. In cultured HUVEC cells HARP modulates the expression of the VEGF receptors. The expression and accumulation of KDR mRNA and protein is reduced, while Flt-1 and Neuropillon-1 expression increases. As a result the cells have limited ability to respond to VEGF stimulation. Harp-stimulated HUVEC cells show reduced levels of VEGF-induced proliferation and migration comparative to untreated cells. The VEGF receptors are absent from BBC cells. HARP reduces the levels of tyrosine phosporylated proteins in HUVEC and BBC cells. The major protein that becomes dephosphorylated upon HARP stimulation is the Focal adhesion kinase (FAK). FAK dephosporylation is integrin independent and takes place only when HARP is added to the apical surface of the endothelial cells. This effect is observed only when the endothelial cell are cultured in medium containing 5% FBS. In serum-free medium HARP induces the phosphorylation of FAK. FAK phosphorylation is also induced by treating HUVEC cell with 2 peptides corresponding to the N and C terminal HARP. It seems that HARP interacts with an identified yet serum factor (VEGF is a possible molecule) and the resulting complex has a different action from the two terminal peptides and the homodimers that forms in serum-free medium. Finally we identified the existence of Anaplastic lymphoma kinase (ALK) a well known HARP receptor only in BBC cells and the existence of a second receptor molecule the Protein-tyrosine phosphatase beta/zeta (RPTPβ/ζ) in both cell types.

Μία πολύ σημαντική βιολογική διαδικασία στην ανάπτυξη των ανώτερων οργανισμών είναι η ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος. Η ανάπτυξη αυτή πραγματοποιείται είτε de novo με τη διαδικασία της νεοαγγειογένεσης είτε με τη διαδικασία της αγγειογένεσης. Η αγγειογένεση είναι μία πολύπλοκη διαδικασία κατά την οποία κάτω από την επίδραση διάφορων αγγειογεννετικών παραγόντων ενδοθηλιακά κύτταρα από υφιστάμενα αγγεία μεταναστεύουν και δημιουργούν καινούργια αγγεία. Στην διαδικασία αυτή εμπλέκεται ένας μεγάλος αριθμός αυξητικών παραγόντων με σημαντικότερο από όλους τον αυξητικό παράγοντα του ενδοθηλίου (vascular endothelial cell growth factor, VEGF). Ένα παράγοντας που εμπλέκεται στη διαδικασία της αγγειογένεσης είναι και η HARP (Heparin affinity regulatory peptide) ένας αυξητικός παράγοντας που ανήκει στην οικογένεια των αυξητικών παραγόντων που παρουσιάζουν συγγένεια με την ηπαρίνη. Στην διατριβή αυτή μελετήθηκε η δράση της HARP στην έκφραση των υποδοχέων του VEGF στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC και BBC και η επίδραση που έχει στη δράση του VEGF στα κύτταρα. Επίσης μελετήθηκαν οι διαδικασίες ενδοκυτταρικής μεταβίβασης σήματος από τη HARP στα κύτταρα αυτά μέσω οδών που περιλαμβάνουν μεταβολές στην φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών στη τυροσίνη. Τέλος πραγματοποιήθηκε ανίχνευση γνωστών υποδοχέων του μορίου στα ενδοθηλιακά κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν ως πειραματικό υλικό. Σε καλλιέργειες κυττάρων HUVEC διαπιστώθηκε ότι η HARP επηρεάζει την έκφραση των υποδοχέων του VEGF. Η έκφραση και η συσσώρευση του KDR μειώνεται ενώ αντίθετα επάγεται η έκφραση των άλλων δύο υποδοχέων του, Flt-1 και της Neuropilin-1 αυξάνεται. Αποτέλεσμα των μεταβολών αυτών είναι τα ενδοθηλιακά κύτταρα να παρουσιάζουν μειωμένη ικανότητα ανταπόκρισης στον VEGF. Στα κύτταρα BBC δεν εκφράζονται οι υποδοχείς του VEGF. Επιπλέον η HARP μειώνει τα επίπεδα των φωσφοτυροσιλιωμένων πρωτεϊνών των κυττάρων με κυριότερη πρωτεΐνη-στόχο την κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK). Η HARP επηρεάζει τη φωσφορυλίωση της FAK μέσω κάποιας οδού μεταβίβασης σήματος ανεξάρτητης από τις ιντεγκρίνες ενώ η μεταβολή αυτή πραγματοποιείται μόνο όταν η HARP παρουσιάζεται στα κύτταρα από την κορυφαία επιφάνεια τους. Η HARP επηρεάζει τη φωσφορυλίωση της FAK μέσω κάποιας οδού μεταβίβασης σήματος ανεξάρτητης από τις ιντεγκρίνες, ενώ η μεταβολή αυτή πραγματοποιείται μόνο όταν η HARP παρουσιάζεται στα κύτταρα από την κορυφαία επιφάνεια τους. Η δράση αυτή παρατηρείται όταν τα κύτταρα καλλιεργούνται παρουσία 5% FCS στο θρεπτικό τους μέσο. Όταν τα κύτταρα καλλιεργούνται απουσία ορού, η HARP επάγει τη φωσφορυλίωση σε τυροσίνη της FAK. Τα δύο ακραία τμήματα της HARP επίσης επάγουν τη φωσφορυλίωση της FAK, ακόμα και όταν τα πειράματα πραγματοποιούνται παρουσία ορού. Φαίνεται ότι η HARP αλληλεπιδρά με κάποιο παράγοντα του ορού - π.χ. τον VEGF - και δρα με διαφορετικό τρόπο σε σχέση με τα 2 ακραία πεπτίδια και τα ομοδιμερή που σχηματίζει η HARP σε θρεπτικό μέσω απουσία ορού. Τέλος, εξετάσαμε την παρουσία των υποδοχέων της HARP, ALK και RPTPβ/ζ στα κύτταρα που χρησιμοποιήσαμε ως πειραματικό υλικό. Ο ALK ανιχνεύεται μόνο στα κύτταρα BBC ενώ η RPTPβ/ζ εντοπίζεται και στα δύο είδη ενδοθηλιακών κυττάρων.