Ταυτοποίηση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με τον αυξητικό παράγοντα πλειοτροπίνη και διερεύνηση του λειτουργικού τους ρόλου

Abstract

Pleiotrophin (PTN) is a growth factor that plays a significant role on tumor growth and angiogenesis. Several receptors interact with PTN and mediate its biological actions, such as N-syndecan, anaplastic lymphoma kinase (ALK) and receptor protein tyrosine phosphatase beta/zeta (RPTPβ/ζ). Our group has previously shown that the ability of PTN to stimulate migratory responses depends on the formation of a functional complex consisting of RPTPβ/ζ and integrin ανβ3. The multifunctional protein nucleolin (NCL), which is over-expressed on the surface of activated endothelial and tumor cells and mediates the stimulatory actions of several angiogenic factors, has been also suggested as a low affinity receptor for PTN, however with unknown functions. In the present study, by using immunoprecipitation/Western blot analyses, double immunofluorescence and proximity ligation assays, we showed that PTN directly interacts with NCL. This interaction involves binding of the amino-terminal domain of PTN (amino acids: 16-24) to the central domain of NCL (amino acids: 308-645). Down-regulation of NCL by siRNA or blockage of cell surface NCL by its ligand 5(KPR)TASP completely abolished PTN-induced endothelial cell migration. Based on the observation that cell surface NCL localization was detected only in cells expressing ανβ3 and by performing immunofluorescence and biochemical studies in cells with genetically altered expression of the studied molecules, we demonstrated that cell surface NCL localization depends on the phosphorylation of β3 at Tyr773 through RPTPβ/ζ and c-src activation. Down-stream of ανβ3, PI3K activity is required for cell surface NCL localization. VEGF165 that also induces cell surface NCL localization acts through binding to RPTPβ/ζ and activation of the RPTPβ/ζ/c-src/ανβ3 signaling pathway. The receptor or the heparin binding sites on the VEGF165 molecule do not seem to be involved in this VEGF165 action. Apart from PI3K, in VEGF165-induced cell surface NCL localization, p38 that lays down-stream of ανβ3, is also involved. Activation of p38 is independent of RPTPβ/ζ and β3 Tyr773 or Tyr785 phosphorylation, and seems to belong to a parallel signaling pathway that remains unclear. Mechanistically, NCL was found to directly interact with ανβ3, RPTPβ/ζ, VEGF165 and VEGFR-2, but only affects the intracellular localization of RPTPβ/ζ and PTN. Positive correlation of cell surface NCL and ανβ3 expression was observed in human glioblastoma tissue arrays. Finally, the monoclonal antibody anti-C23 and the peptides targeting cell surface NCL, 5(KPR)TASP, HB-19 and Nucant 6L, significantly inhibited migration of cells expressing ανβ3 in the presence of serum, while they had a minor or no effect on cells lacking ανβ3 or over-expressing mutant β3 with replacement of cytoplasmic tyrosine 773 to phenylalanine. Collectively, these data suggest that ανβ3 expression and β3 phosphorylation at Tyr773 downstream of the RPTPβ/ζ/c-src signaling cascade determines the cell surface localization of NCL, which is required for cell migration induced by both PTN and VEGF165. Moreover, expression of ανβ3 could be used as a biomarker for the use of cell surface NCL antagonists as anticancer agents.

Η πλειοτροπίνη (PTN) αποτελεί έναν αυξητικό παράγοντα με ποικίλες δράσεις και σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη όγκων και την αγγειογένεση. Διάφοροι υποδοχείς αλληλεπιδρούν με την ΡΤΝ και διαμεσολαβούν τις βιολογικές της δράσεις, όπως η Ν-συνδεκάνη, ο ALK (κινάση αναπλαστικού λεμφώματος) και ο RPTPβ/ζ (υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ). Η ερευνητική μας ομάδα έχει δείξει σε προηγούμενη μελέτη ότι η ικανότητα της PTN να επάγει κυτταρική μετανάστευση εξαρτάται από το σχηματισμό ενός λειτουργικού συμπλόκου που αποτελείται από τον RPTPβ/ζ και την ιντεγκρίνη ανβ3. Η πολυ-λειτουργική πρωτεΐνη νουκλεολίνη (NCL), η οποία υπερεκφράζεται στην επιφάνεια ενεργοποιημένων ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων και διαμεσολαβεί τις διεγερτικές δράσεις διαφόρων αγγειογενετικών παραγόντων, έχει επίσης προταθεί ως υποδοχέας χαμηλής συγγένειας για την ΡΤΝ, με άγνωστες όμως λειτουργίες. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε, με τη χρήση μεθόδων ανοσοκατακρήμνισης-ανοσοαποτυπώματος, διπλού ανοσοφθορισμού και προσδιορισμού αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας, ότι η PTN αλληλεπιδρά άμεσα με τη NCL. Η αλληλεπίδραση αυτή περιλαμβάνει πρόσδεση της αμινοτελικής περιοχής της ΡΤΝ (αμινοξέα: 16-24) στην κεντρική περιοχή της NCL (αμινοξέα: 308-645). Μείωση της έκφρασης της NCL με siRNA ή λειτουργική αναστολή της μεμβρανικής NCL από το πεπτίδιο 5(KPR)TASP ανέστειλε πλήρως την επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων. Με αφετηρία την παρατήρηση ότι ο εντοπισμός της NCL στην κυτταρική επιφάνεια ανιχνεύθηκε μόνο σε κύτταρα που εκφράζουν την ανβ3, και πραγματοποιώντας πειράματα ανοσοφθορισμού και βιοχημικές μελέτες σε κύτταρα με γενετικά τροποποιημένη έκφραση των υπό μελέτη μορίων, δείξαμε ότι ο εντοπισμός της NCL στην πλασματική μεμβράνη εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση της β3 στην τυροσίνη 773 μέσω ενεργοποίησης του RPTPβ/ζ και της c-src. Καθοδικά της ανβ3, η PI3K συμμετέχει σε αυτή τη δράση. Ο VEGF165 που επίσης επάγει το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL, δρα μέσω δέσμευσης στον RPTPβ/ζ και ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού RPTPβ/ζ/c-src/ανβ3. Η περιοχή δέσμευσης στους υποδοχείς VEGFR-1 και VEGFR-2 ή η περιοχή δέσμευσης στην ηπαρίνη στο μόριο του VEGF165 δεν εμπλέκονται στον επαγόμενο από VEGF165 εντοπισμό της NCL στην κυτταρική μεμβράνη. Εκτός από την PI3K, στη δράση του VEGF165 καθοδικά της ανβ3 εμπλέκεται και η κινάση p38, η ενεργοποίηση της οποίας είναι ανεξάρτητη από τον RPTPβ/ζ και τη φωσφορυλίωση της β3 στις τυροσίνες 773 ή 785, και φαίνεται να ανήκει σε μονοπάτι που ενεργοποιείται παράλληλα και που παραμένει αδιευκρίνιστο. Μηχανιστικά, η NCL βρέθηκε να αλληλεπιδρά άμεσα με την ανβ3, τον RPTPβ/ζ, τον VEGF165 και τον VEGFR-2, αλλά επηρεάζει τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό μόνο του RPTPβ/ζ και της PTN. Θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε ως προς την έκφραση της μεμβρανικής NCL και της ανβ3 σε μικροσυστοιχίες ιστών προερχόμενων από ανθρώπινα γλοιοβλαστώματα. Τέλος, βρέθηκε ότι το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-C23 και τα πεπτίδια που στοχεύουν τη μεμβρανική NCL, 5(KPR)TASP, ΗΒ-19 και Nucant 6L, ανέστειλλαν σημαντικά τη μετανάστευση κυττάρων που εκφράζουν ανβ3, ενώ είχαν μικρή ή καθόλου δράση στη μετανάστευση κυττάρων που δεν εκφράζουν ανβ3 ή υπερεκφράζουν μετάλλαγμα της β3 με αντικατάσταση της κυτταροπλασματικής τυροσίνης 773 σε φαινυλαλανίνη. Συνολικά, από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προκύπτει ότι η έκφραση της ανβ3 και η φωσφορυλίωση της β3 στην τυροσίνη 773 καθορίζουν τον εντοπισμό της NCL στην κυτταρική επιφάνεια, καθοδικά του σηματοδοτικού μονοπατιού RPTPβ/ζ/c-src που συμμετέχει στην κυτταρική μετανάστευση που επάγεται τόσο από την ΡΤΝ, όσο και από τον VEGF165. Επίσης, φαίνεται ότι η έκφραση της ανβ3 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως βιοδείκτης για τη χρήση ανταγωνιστών της μεμβρανικής NCL ως αντικαρκινικών παραγόντων.