Δράση παραγόντων παθογένειας βακτηρίων στο μηχανισμό της γονιδιακής σίγησης

Abstract

Many plant pathogenic bacteria inject compositionally and functionally diverse repertoires of effector proteins into the plant cell interior through Type Three Secretion Systems (T3SSs)]. Plant Resistance (R) genes mediate recognition of effectors and induce Effector-Triggered Immunity. R gene mediated resistance is often expressed as localized programmed cell death (Hypersensitive Response, HR) accompanied by accumulation of antimicrobial metabolites, restricting the proliferation of biotrophic pathogens. Effector proteins promote bacterial virulence by manipulating specific physiological processes or signaling pathways to subvert host immunity and suppress plant defenses (Pattern-Triggered Immunity [PTI] and Effector-Triggered Immunity [ETI]). RNA interference (RNAi) is an immunity mechanism in which double-stranded RNAs are processed into 21-25 nt short interfering RNAs (siRNAs). RNA interference is a conserved regulatory process that has evolved as a defense mechanism in plants and animals. Plant pathogenic bacteria encounter host defenses mediated by a variety of small RNAs (miRNAs, nat-siRNAs, lsiRNAs etc).Here, we show that RNA interference is a novel negative regulator of necrosis induced by various elicitors of HR: a) Harpin (HrpZ), a protein elicitor supplied to the plant in purified form at relatively high concentrations, b) effector proteins injected through T3SS into the host cell cytosol, c) effectors produced endogenously in the plant cells following agrodelivery of effector-coding genes. At least in some cases, regulation of plant cell death by RNA interference is temperature-dependent.Plant pathogenic viruses, bacteria fungi and οomycetes encode suppressor proteins of RNA interference. Our results provide further evidence that bacterial T3S-secreted effector proteins may manipulate the plant siRNA pathways not only by suppressing but also by enhancing silencing efficiency. We provide evidence that transient expression of different members of an effector superfamily (HopF) from phytopathogenic Pseudomonas syringae in transgenic Nicotiana benthamiana line 16c over-expressing a green fluorescent protein (GFP), suppressed sense-post-transcriptional gene silencing (s-PGTS) triggered by agro infiltration of a GFP-over expressing cassette while other members of the same superfamily enhanced gene silencing. Using truncated versions of these effector proteins, we identified distinct N- and C-terminal domains that are sufficient for both silencing suppression and inhibition of plant cell death. Through targeted mutagenesis we further identified clustered residues in conserved motifs of some effector proteins that are required for silencing suppression in N. benthamiana and cell death inhibition in both N. benthamiana and Nicotiana tabacum. Finally, we provide evidence that the E3 ubiquitin ligase domain of HopAB2 as sufficient for both silencing enhancement and inhibition of plant cell death. Site-directed substitutions in the full-length HopAB2 protein which mildly reduce its E3-ligase activity also contribute in HopAB2 silencing enhancement phenotype.Our analysis extends the range of known suppressor (and enhancer) proteins from P. syringae and provides clues about the role of silencing suppression (and enhancement) in plant-microbe interactions. Furthermore, it uncovers criticalparameters for cell death inhibition by members of effector protein superfamilies. The interplay between gene silencing, plant cell death and effector proteins is discussed

Πολλά είδη φυτoπαθογόνων βακτηρίων ενχύουν ρεπερτόρια πρωτεϊνών-τελεστών (T3SS effectors, Τ3SEs, τελεστές, διεγέρτες) μέσω εξειδικευμένου συστήματος έκκρισης πρωτεϊνων (Συστημά Έκκρισης πρωτεϊνών Τυπου ΙΙΙ, Type Three Secretion Systems, [T3SS)]. Οι πρωτεϊνες αυτές αναγνωρίζονται από υποδοχείς του φυτού οι οποίοι κωδικεύονται απο τα ονομαζόμενα R-γονίδια (resistance genes). Η αναγνώριση «λειτουργικά αντίστοιχων» πρωτεϊνών-τελεστών και υποδοχέων πυροδοτεί την εκδήλωση μιας μορφής ανοσίας (ανοσία επαγωμενη απο πρωτετεϊνες-τελεστές,Effector-Triggered Immunity, ΕΤΙ). Η ανοσία αυτή περιορίζει την ανάπτυξη βιότροφων παθογόνων, συχνά με την πρόκληση μιας μορφής προγραματισμένου τοπικού κυτταρικού θανάτου που ονομάζεται αντίδραση υπερευαισθησίας (Hypersensitive Response, HR). Όταν η αναγνωριση αυτή δεν συμβαίνει, οι πρωτεΐνες-τελεστές προάγουν τη βακτηριακή παθογένεια παρεμβαίνοντας σε συγκεκριμένες φυσιολογικές διεργασίες ή σηματοδοτικά μονοπάτια που τελικά καταστέλλουν μηχανισμούς άμυνας των φυτών. Η RNA σίγηση (αποσιώπηση) γονιδίων (RNA interference, RΝΑi) είναι ένας μηχανισμός κατασταλτικού ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης στον οποίο δίκλωνα μόρια RNA μετατρέπονται σε ολιγονουκλεοτίδια μήκους 21-25 nt (siRNAs). Η RNA σίγηση είναι μια συντηρημένη ρυθμιστική διαδικασία που έχει εξελιχθεί ως μηχανισμός άμυνας στα φυτά και τα ζώα. Πολλά φυτοπαθογόνα βακτήρια καταστέλλουν τις άμυνες του ξενιστή που προκαλούνται από μια ποικιλία μικρών RNAs (miRNAs, nat-siRNAs, lsiRNAs κλπ)Στην παρούσα διατριβή αναλύεται η αλληλεπίδραση μεταξύ RNA σίγησης, κυτταρικού θανάτου και πρωτεϊνών τελεστών και καταδεικνύεται η παρεμβολή της RNAί- ως αρνητικού ρυθμιστή του κυτταρικού θανάτου που επάγεται στα φυτά από διάφορους διεγέρτες όπως: α) ένα διεγέρτη (HrpZ) που παρέχεται στο φυτό σε καθαρισμένη μορφή σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις, β) πρωτεϊνες- διεγέρτες που παραγονται στα βακτηριακ κύτταρά και ενχύονται μέσω T3SS στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου ξενιστή, γ) πρωτεϊνες-διεγέρτες που παρέχονται μέσω αγροένχυσης (agroinfiltration) και εκφράζονται ενδογενώς στα φυτικά κύτταρα. Σε ορισμένες τουλαχιστον περιπτωσεις που εξετάστηκαν, η ρύθμιση κυτταρικού θανάτου στα φυτά μέσω RNA σίγησης εξαρτάται από τη θερμοκρασία.Πολλοί φυτοπαθογόνοι ιοί, μύκητες, βακτήρια και ωομύκητες κωδικοποιούν πρωτεΐνες καταστολής της RNA σίγησης. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν περαιτέρω αποδείξεις ότι οι T3SS πρωτεΐνες-τελεστές μπορούν να αλληλεπιδράσουν με τα φυτικά siRNA μονοπάτια, με στόχο όχι μόνο με την καταστολή αλλά και την ενίσχυση της RNA σίγησης. Στην παρούσα διατριβή, παρέχουμε αποδείξεις ότι παροδική έκφραση διαφορετικών μελών μιας υπεροικογένειας (HopF) πρωτεϊνών-τελεστών από φυτοπαθογόνα στελέχη Pseudomonas στην διαγονιδιακή σειρά Nicotiana benthamiana 16c [η οποία υπερεκφράζει μία πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP)], κατέστειλε την γονιδιακή σίγηση που ενεργοποιείται μετα-μεταγραφικά από αγροένχυση μιας κασέτας που υπερεκφράζει GFP, ενώ άλλα μέλη της ίδιας υπεροικογένειας ενισχύουν τη γονιδιακή σίγηση. Χρησιμοποιώντας τμηματικές ελλείψεις αυτών των πρωτεϊνών τελεστών, ταυτοποιήθηκαν διακριτές αμινοτελικές και καρβοξυτελικές περιοχές που είναι επαρκείς τόσο για την καταστολή της RNA σίγησης όσο και για την αναστολή του θανάτου των φυτικών κυττάρων. Στοχευμένη μεταλλαξιγένεση αποκάλυψε κρίσιμα καταλοιπα συντηρημένων μοτίβων ορισμένων πρωτεϊνών τελεστών που απαιτούνται για καταστολή RNA σίγησης στην Ν. benthamiana και αναστολή κυτταρικού θανάτου τόσο σε Ν. benthamiana όσο και Nicotiana tabacum .Επιπλέον, προσδιορίσαμε ότι η ενεργότητα Ε3 λιγάσης ουβικιτίνης του HopAB2 είναι επαρκής τόσο για ενίσχυση σίγησης όσο και αναστολή κυτταρικού θανάτου στα φυτά. Τοπο-κατευθυνόμενες μεταλλαγές υποκατάστασης συντηρημένων αμινοξέων στην πλήρους μήκους πρωτεΐνης HopAB2 που έχουν να αποτέλεσμα ήπια μείωση ενεργότητας Ε3 λιγάσης συμβάλλουν επίσης στον φαινότυπο της ενίσχυσης RNA σίγησης από το HopAB2.Η ανάλυσή μας επεκτείνει το φάσμα των γνωστών καταστολέων (και ενισχυτών) σίγησης πρωτεϊνών από παθοτυπους του είδους P. syringae και παρέχει ενδείξεις για το ρόλο της καταστολής (και ενίσχυσης) της RNA σίγησης στις αλληλεπιδράσεις παθογόνων-ξενιστών. Επιπλέον, αποκαλύψαμε κρίσιμες παραμέτρους για την αναστολή του κυτταρικού θανάτου από υπεροικογένειες πρωτεϊνών-τελεστών.