Time-Resolved Step-Scan FTIR μελέτη του κυτοχρώματος ba3 από το Thermus thermophilus και φασματοσκοπική μελέτη του συστήματος Fe/Bleomycin/DNA

Abstract

The focus of this thesis was on the study of cytochrome ba3 oxidase from Thermus thermophilus and on the drug of bleomycin (BLM). Cytochrome ba3 oxidase catalyzes the reduction of O2 to H2O and that of NO to N2O. The active center consists of a heme a3-CuB binuclear center and as a prosthetic group there are a low spin heme b and a homodinuclear CuA complex. We used as main spectroscopic technique the time-resolved step-scan FTIR, a structure-sensitive tool, and through the model complex of cytochrome ba3-CO, we detected and characterized important properties of the binuclear center, observed for the first time in analogous systems. In a primary study, we observed the equilibrium CuB 1+-CO complex. This complex was unchanged in a large scale of pDs demonstrating the stability of the CuB histidine ligands. The time-resolved step-scan FTIR data, along with the observed rate constants, revealed a structural change of the heme a3 propionic group during the photodissociation of CO from heme Fe. Next step was the unexpected observation of the oxygen-linked equilibrium CuB 1+-CO complex, the first experimental proof for the existence of a ligand-input channel at the CuB site. In the presence of low-oxygen concentrations the CuB1+-CO complex is subjected to a structural reorganiztion, facilitating this way the entry of O2 to the active binuclear center. In a third study we emphasized on the protein dynamics of the heme a3-CuB binuclear center of cytochrome ba3. The kinetic analysis of the observed protein-linked vibrational modes showed that the rate constants are comparable to those reported for the transient CuB 1+- CO complex. Also, through the identified protonic connectivity between the heme a3 propionic group and the Asp372 residue, we proposed a model for the H+, H2O output channelin cytochrome c oxidase. Fourth step was the detection of the CO ligand in a secondary docking site and its escape to the solvent. The access in the structure of these transient states has great extension to the biological function of the enzyme. The observation of the intermediate states ofphotolyzed CO leads to a further insight in the understanding of cytochrome c dynamics. In the second part of this thesis we studied the CO-Fe-BLM complex in the absence and in the presence of DNA. The FTIR spectra revealed no changes in the C-O vibrational mode indicating the absence of interactions between the BLM and the DNA in the active center of the complex.

Στόχος αυτής της διατριβής ήταν η φασματοσκοπική μελέτη της τύπου ba3 κυτοχρωμικής c οξειδάσης από το βακτήριο Thermus thermophilus και του αντικαρκινικού συμπλόκου των bleomycins. Η ba3 κυτοχρωμική οξειδάση καταλύει την αναγωγή του μοριακού οξυγόνου Ο2 σε νερό Η2Ο και του μονοξειδίου του αζώτου ΝΟ σε μονοξείδιο του διαζώτου N2O. Το ενεργό κέντρο του μορίου περιλαμβάνει ένα διπυρηνικό κέντρο αίμης α3- CuB, ενώ επιπλέον δομική μονάδα αποτελεί και μία αίμη b. Χρησιμοποιώντας ως βασική φασματοσκοπική τεχνική την time-resolved step-scan FTIR και ως μοντέλο των βιολογικά ενεργών συμπλόκων τη δεσμευμένη με CO μορφή του ενζύμου, ανιχνεύσαμε και ταυτοποιήσαμε σημαντικές ιδιότητες του διπυρηνικού κέντρου οι οποίες παρατηρήθηκαν για πρώτη φορά σε τέτοιου μεγέθους σύστημα. Η πλήρης μελέτη της δυναμικής του ενεργού κέντρου επιβεβαίωσε τον χαρακτηρισμό που είχε αποδωθεί παλαιότερα στο κυτόχρωμα ba3, ως ενζύμου με ιδιόμορφα χαρακτηριστικά, κατά την αλληλεπίδραση του με εξωγενείς υποκαταστάτες, ταυτόχρονα όμως άνοιξε τον δρόμο σε επόμενες μελέτες οι οποίες θα έχουν ως τελική κατάληξη την καλύτερη κατανόηση των φαινομένων δυναμικής, αλλά και των διαφορών στην δραστικότητα που επιδεικνύουν δομικά όμοιες ενώσεις, κατά την φυσιολογική καταλυτική τους λειτουργία. Οι bleomycins ανήκουν σε μία τάξη γλυκοπεπτιδικών, αντικαρκινικών, αντιβιοτικών παραγόντων και ως φυσικό προϊόν απομονώνονται από το βακτήριο Streptomyces verticillus. H ενδοκυτταρική τοξική τους δράση είναι αποτέλεσμα της ικανότητας δέσμευσης του σιδήρου Fe και της οξειδοαναγωγικής ενεργοποίησης του μοριακού οξυγόνου. Οι bleomycins πιστεύεται ότι ασκούν την βιολογική τους δράση μέσω της δέσμευσης και αποικοδόμησης του DNA, μία διαδικασία η οποία είναι εξαρτώμενη από το μεταλλικό ιόν και το οξυγόνο και οδηγεί στη διάσπαση τόσο του μονόκλωνου, όσο και του δίκλωνου DNA, με το τελευταίο να είναι το πιο σημαντικό βιολογικά γεγονός και να συμβαίνει επιλεκτικά στις θέσεις 5΄-GC ή 5΄-GT. Το ενεργό κέντρο του συμπλόκου περιλαμβάνει το μεταλλικό ιόν του σιδήρου το οποίο είναι συναρμοσμένο με πέντε άτομα αζώτου του μορίου των bleomycins. Με την χρήση της φασματοσκοπικής τεχνικής FTIR μελετήσαμε το δεσμευμένο με CO σύμπλοκο, μοντέλο του βιολογικά ενεργού μορίου, CO-Fe2+-BLM, παρουσία και απουσία DNA. Τα time-resolved step-scan FTIR πειράματα με 5 μs χρονική διακριτική ικανότητα δεν στάθηκαν ικανά να μας δώσουν πληροφορίες για το σύστημα μας, καθιστώντας αναγκαία την απόκτηση πειραματικής διάταξης με ns (10-9 s) χρονική ανάλυση. Με την χρήση της φασματοσκοπίας UV/Vis μελετήθηκε η αντίδραση του συμπλόκου Fe-BLM με το οξυγόνο Ο2, αλλά και το υπεροξείδιο του υδρογόνου Η2Ο2, παρουσία και απουσία του DNA, αλλά και παρουσία ολιγονουκλεοτιδίων συγκεκριμένης αλληλουχίας. Το επόμενο βήμα σε αυτή τη μελέτη αποτελούσε η time-resolved resonance Raman δονητική ανίχνευση των ενδιαμέσων των παραπάνω αντιδράσεων. Σημαντικά προβλήματα που είχαν να κάνουν με τη φύση του όλου συστήματος (ασθενής σκεδαστής και ανάγκη για εύρεση πηγής διέγερσης συγκεκριμένου μήκους κύματος στα 385 nm) κατέστησαν ανέφικτη την ουσιαστική πραγματοποίηση των time-resolved resonance Raman πειραμάτων με το αυτή την στιγμή διαθέσιμο laser διόδου (416 nm). Παράλληλα εμφανίστηκαν στην βιβλιογραφία resonance Raman εργασίες με βάση το σύμπλοκο Co-BLM, το οποίο όντας μη δραστικό απλά δεσμεύει το μόριο του οξυγόνου, χωρίς όμως να προχωράει στην κατάλυση του και στην παραγωγή των μικρού χρόνου ζωής ενδιαμέσων. Αυτό το γεγονός φυσικά διευκόλυνε την ανίχνευση των σχετιζόμενων με το Ο2 δονήσεων και έθεσε την πρώτη βάση δονητικού χαρακτηρισμού του συστήματος. Παρά ταύτα, σημαντικά ζητήματα πάνω στην βιολογικά ενεργή πορεία του συμπλόκου Fe-BLM (ανίχνευση ενδιαμέσων οξυγόνου, αλληλεπίδραση με το DNA, RNA) παραμένουν ανοικτά και προγραμματίζονται για το μέλλον, όταν η πρόσβαση σε laser μήκους κύματος εκπομπής 365-385 nm γίνει ευκολότερη (laser μίγματος αερίων Kr/Ar ή laser διόδου).