Εκτίμηση απορροφούμενης δόσης και εξατομίκευση επικινδυνότητας της έκθεσης σε ιοντίζουσες ακτινοβολίες βάσει των επαγόμενων χρωμοσωματικών αλλοιώσεων σε λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος

Abstract

For the evaluation and the estimation of the risk after an exposure to ionizing radiation, is necessary the estimation of the absorbed dose. The absorbed dose is estimated with physical and biological methods. The biological methods are using the chromosomal aberrations of peripheral blood lymphocytes that caused after the interaction of DNA with the ionizing radiation. The conventional biodosimetry method is based on the interpolation of the frequency of dicentrics chromosomes and rings with centromeres scored in blood lymphocytes at metaphase to a pre established dose effect calibration curve. Nevertheless, the conventional method has disadvantages: i) the analysis of dicentrics chromosomes at metaphase presupposes lymphocyte stimulation and a two day culture, failing the need for rapid estimation of the dose, ii) after exposures to very high doses, appears dicentrics saturation at the scoring analysis, that finally means sub-estimation of the absorbed dose, iii) the difficulty of the estimation of the absorbed dose after partial body exposures due to the two day lymphocyte culture and the delay of irradiated cells at the cell cycle. In the present study to overcome the shortcomings of the conventional method we induced three different more rapid, accurate and reliable approaches for the estimation of the absorbed dose after high and low exposures. At the first approach fluorescence in situ hybridization (FISH) technique with centromeric/telomeric peptide nucleid acid probes (C/T PNA) in combination with conventional dicentric analysis was used. This approach improved the precision at the analysis of dicentric and polycentric chromosomes. At the second approach a modified protocol using a short co-treatment with caffeine and colcemid before lymphocyte harvesting was used, so that the lymphocytes released from the G2 block were predominantly included in the dicentric analysis. Additional the use of FISH technique with C/T probes validated our hypothesis and enabled the identification and scoring accurately the frequency of dicentrics. The dose effect calibration curve was constructed and for higher doses without saturation. Finally at the third approach the Premature Chromosome Condensation (PCC) in blood lymphocytes by means of their fusion with Chinese Hamster Ovary (CHO) mitotic cells was used. Analysis after Giemsa staining and after FISH C/T probes was held. This method enabled the analysis of radiation induced aberrations, directly in non stimulated G0 lympocytes. The results presented that all the approaches can estimate the absorbed dose with better precision and ease when compared with the conventional biodosimetry method. However the third approach with the use of PCC method shown to be more reliable, sensitive, accurate and faster than the other approaches, especially when there is a need for a fast estimation of absorbed dose, like after a nuclear accident, where a categorization of exposed individuals is need for better medical treatment.

Για την αξιολόγηση και την εκτίμηση του κινδύνου που εγκυμονεί η έκθεση σε ιοντίζουσες ακτινοβολίες είναι απαραίτητο να εκτιμηθεί η απορροφούμενη δόση. Η εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης επιτυγχάνεται τόσο με φυσικές μεθόδους, όσο και με μεθόδους βιολογικές. Οι βιολογικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται εκμεταλλεύονται κυρίως τις χρωμοσωμικές αλλοιώσεις και ανακατατάξεις που προκαλούνται από την αλληλεπίδραση του γενετικού υλικού με ιοντίζουσα ακτινοβολία. Στην κλασσική κυτταρογενετική μεθοδολογία τα δικεντρικά χρωμοσώματα και οι δακτύλιοι οι οποίοι δημιουργούνται και η συχνότητα εμφάνισής τους ανά κύτταρο είναι συνάρτηση της απορροφούμενης δόσης. Χρησιμοποιώντας τις αλλοιώσεις αυτές ως δείκτη της έκθεσης, η απορροφούμενη δόση προσδιορίζεται μέσω πρότυπων καμπύλων αναφοράς. Ωστόσο, η κλασσική μέθοδος, όπως εφαρμόζεται σήμερα, εμφανίζει ορισμένα μειονεκτήματα: i) το μεγάλο χρονικό διάστημα (3 ημέρες ) που απαιτείται για τη εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης, ii) το κορεσμό δικεντρικών χρωμοσωμάτων που παρουσιάζεται κατά την ανάλυση ύστερα από υψηλές εκθέσεις όπου έχει ως συνέπεια την υποεκτίμηση της απορροφούμενης δόσης iii) την δυσκολία στην εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης, στην περίπτωση μη ολόσωμης έκθεσης λόγω της απαιτούμενης καλλιέργειας και της καθυστέρησης των ακτινοβολημένων λεμφοκυττάρων στον κυτταρικό κύκλο. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η υπέρβαση των μειονεκτημάτων της κλασσικής μεθοδολογίας χρησιμοποιώντας τρεις νέες πιο ευαίσθητες, αξιόπιστες και ακριβείς προσεγγίσεις για την ταχεία εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης μετά από έκθεση τόσο σε χαμηλές όσο και σε υψηλές δόσεις. Στην πρώτη προσέγγιση χρησιμοποιήθηκαν ειδικοί μοριακοί ιχνηθέτες DNA για την επισήμανση των κεντρομεριδίων και των τελομεριδίων των χρωμοσωμάτων (pancentromeric and telomeric DNA probes) σε συνδυασμό με την κλασσική κυτταρογενετική μέθοδο, ώστε να βελτιωθεί η ακρίβεια ανάλυσης των δικεντρικών χρωμοσωμάτων και δακτυλίων. Στη δεύτερη προσέγγιση εφαρμόστηκε ο χημικός παράγοντας της καφεΐνης, για την άρση του G2 σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου ώστε τα κύτταρα με αυξημένο αριθμό δικεντρικών χρωμοσωμάτων να μπορέσουν να απεγκλωβιστούν από τη G2 φάση και να φθάσουν στη μετάφαση για ανάλυση. Επιπλέον, με την προσθήκη και ειδικών μοριακών ιχνηθετών DNA για την επισήμανση των κεντρομεριδίων και των τελομεριδίων των χρωμοσωμάτων, επιτεύχθηκε η απευθείας παρατήρηση και ποσοτικοποίηση με ακρίβεια του αυξημένου αριθμού δικεντρικών χρωμοσωμάτων και δακτυλίων στα λεμφοκύτταρα, τα οποία μόλις απελευθερώθηκαν από το G2 σημείου ελέγχου. Κατασκευάστηκε επομένως καμπύλη αναφοράς απορροφούμενης δόσης-απόκρισης χωρίς την εμφάνιση κορεσμού ακόμη και στις υψηλές δόσεις. Τέλος στη τρίτη προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε η Μέθοδος της Πρόωρης Χρωμοσωματικής Συμπύκνωσης (Premature Chromosome Condensation - PCC) των λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος που επάγεται μέσω της σύντηξης των λεμφοκυττάρων με μιτωτικά κύτταρα Chinese Hamster Ovary (CHO) ώστε η εκτίμηση των απορροφούμενων δόσεων να γίνεται πλέον σε τρεις ώρες αντί των τριών ημερών που απαιτούνται με την κλασσική κυτταρογενετική μεθοδολογία. Η ανάλυση έγινε με απλή χρώση Giemsa καθώς και με τη χρήση ειδικών μοριακών ιχνηθετών DNA για την επισήμανση των κεντρομεριδίων και των τελομεριδίων των χρωμοσωμάτων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και με τις τρείς προσεγγίσεις η εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης γίνεται με μεγαλύτερη ευκολία και ακρίβεια σε σχέση με την κλασσική κυτταρογενετική μεθοδολογία. Ωστόσο, η μέθοδος της Πρόωρης Χρωμοσωματικής Συμπύκνωσης και η περαιτέρω ανάπτυξή της εμφανίζεται ως η πλέον υποσχόμενη προσέγγιση όταν η ταχεία εκτίμηση της απορροφούμενης δόσης είναι απαραίτητη, όπως σε περιπτώσεις ατυχήματος και έκθεσης πολλών μελών του πληθυσμού, όπου η ταξινόμηση τους σε ομάδες διαφορετικής επικινδυνότητας είναι αναγκαία ώστε να τους παρασχεθεί η βέλτιστη ιατρική περίθαλψη και παρακολούθησή τους.