Μέθοδοι βαθμωτής έκλουσης σε στήλες υγρής χρωματογραφίας διαφόρων τύπων για το διαχωρισμό παραγώγων αμινοξέων με ηλεκτροχημική, φθορισμομετρική και φασματοφωτομετρική ανίχνευση

Abstract

The main object of this PhD was the development of different gradient elution methods in reversed-phase liquid chromatography. The theory of dual-mode gradient elution, including the organic modifier concentration coupled with flow rate variations, has been developed for the first time. The mathematic model which was developed to describe the above separation process was applied successfully for the separation of 18 o-phtalaldehyde derivatives of amino acids in conventional reversed-phase columns. The amino acid derivatives were detected by using UV, fluorimetric and electrochemical detector in series. The optimum conditions of electrochemical detection were found by an extensive electrochemical study. The theory of dual-mode gradient was tested for our experimental system with eluting systems modified by acetonitrile or methanol. The retention prediction obtained for all solutes under all dual-mode gradient conditions was excellent. After the above study, the mathematic model was tested for the separation of the amino acids derivatives using monolithic reversed-phase columns. The results showed that the theory of dual-mode gradient involving combined gradients of the mobile phase composition with flow rate can be used successfully with high flow rates. Finally, we used the column temperature as an additional factor in the optimization of the chromatographic separation of the amino acid derivatives. This study allowed the selection of the best combination of the column temperature with the optimal profile of the simultaneous variation of the mobile-phase composition and the flow rate that was expected to give maximal resolution in the shorter run time for the solutes under consideration. The main conclusion of this PhD is that the combination of the two gradient elution mode, that is, the concentration of the organic modifier and the flow rate in different but constant temperatures, can contribute in the field of the optimization of the separations with HPLC. The algorithms developed in this PhD can help the chromatographers to use and optimize multi-mode gradient elution conditions in order to separate complex samples with the maximal resolution in as short time as possible.

Στόχος της παρούσης διατριβής ήταν η ανάπτυξη διαφόρων μεθόδων βαθμωτής έκλουσης στην υγρή χρωματογραφία αντίστροφης φάσης. Έτσι, αναπτύχθηκε για πρώτη φορά η θεωρία μίας βαθμωτής έκλουσης διπλού τύπου που περιλαμβάνει ταυτόχρονη μεταβολή τόσο στη συγκέντρωση του οργανικού διαλύτη στην κινητή φάση όσο και στην ταχύτητα ροής. Το μαθηματικό μοντέλο που προέκυψε για την περιγραφή της ταυτόχρονης μεταβολής της σύστασης της κινητής φάσης και της ταχύτητας ροής με το χρόνο εφαρμόστηκε με επιτυχία στο διαχωρισμό δεκαοχτώ παραγώγων αμινοξέων με ο-φθαλαλδεύδη σε συμβατική στήλη αντίστροφης φάσης. Η ανίχνευση των παραγώγων αμινοξέων γινόταν με τη χρήση σε σειρά τριών ανιχνευτών, φασματοφωτομετρικού, φθορισμομετρικού και ηλεκτροχημικού. Οι βέλτιστες συνθήκες ηλεκτροχημικής ανίχνευσης βρέθηκαν μετά από μία διεξοδική ηλεκτροχημική μελέτη. Η πρόβλεψη των χρόνων συγκράτησης για το πειραματικό μας σύστημα με εκλουστικά συστήματα τροποποιημένα με ακετονιτρίλιο ή μεθανόλη κάτω από συνθήκες διπλού τύπου βαθμωτής έκλουσης ήταν πάρα πολύ ικανοποιητική. Στη συνέχεια το μαθηματικό μοντέλο που αναπτύχθηκε εφαρμόστηκε για το διαχωρισμό των παραγώγων αμινοξέων και σε μονολιθική στήλη αντίστροφης φάσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεωρία που αναπτύχθηκε μπορεί να εφαρμοστεί με επιτυχία και σε μεγάλες ταχύτητες ροής που απαιτούνται για τον καλό διαχωρισμό σε μονολιθικές στήλες και δεν περιορίζεται η εφαρμογή της σε μικρές ταχύτητες ροής που επιβάλλουν οι συμβατικές στήλες χρωματογραφίας. Τέλος, χρησιμοποιήθηκε και η θερμοκρασία της στήλης ως ένας επιπλέον παράγοντας βελτιστοποίησης του χρωματογραφικού διαχωρισμού των παραγώγων των αμινοξέων. Η μελέτη αυτή επέτρεψε την εύρεση της βέλτιστης θερμοκρασίας διαχωρισμού, καθώς και της βέλτιστης ταυτόχρονης μεταβολής του οργανικού διαλύτη και της ταχύτητας ροής που οδηγεί στον καλύτερο διαχωρισμό των υπό μελέτη ουσιών. Το συμπέρασμα που προέκυψε από τη διατριβή είναι ότι ο συνδυασμός των δύο τύπων βαθμωτής έκλουσης (σύσταση κινητής φάσης και ταχύτητα ροής) σε διάφορες αλλά σταθερές θερμοκρασίες μπορεί να συμβάλλει τα μέγιστα στη βελτιστοποίηση των διαχωρισμών με HPLC. Οι αλγόριθμοι της διατριβής αυτής μπορούν να αποτελέσουν ένα μέρος ενός σύνθετου πακέτου προγραμμάτων βελτιστοποίησης διαχωρισμών με HPLC που θα δίνει τη δυνατότητα στους επιστήμονες που μέχρι σήμερα εύρισκαν τις βέλτιστες συνθήκες διαχωρισμού ενός δείγματος εμπειρικά, να τις προβλέψουν θεωρητικά και να τις εφαρμόσουν στη συνέχεια με επιτυχία στην πράξη ιδιαίτερα όταν πρόκειται για δύσκολους διαχωρισμούς.