Μελέτη αποπτωτικών μηχανισμών και μορίων που συμμετέχουν στα χρόνια λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα

Abstract

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is thought to be primarily caused bydefects in programmed cell death (apoptosis), since it is characterized by agradual accumulation of small, long-living, immunologically dysfunctionalmature B-lymphocytes, most of which are in the Go/early G1 phase of the cellcycle. It has also been reported that CLL cells have a proliferation rate higherthan previously recognized, particularly in the lymphoid tissues.CLL/small lymphocytic leukemia (SLL) lymph node infiltration has a distinctivehistological feature, the so-called pseudofollicles or proliferation centers (PCs),which are less evident in the bone marrow and the white pulp of the spleen.PCs, which appear as vaguely nodular pale staining areas against amonotonous dark background of small mature lymphocytes, contain a pool ofproliferating cells. In the present study, we have analyzed theimmunohistochemical expression of a wide range of molecules participatingin/or interacting with both apoptotic pathways, namely, Fas, FasL, c-FLIP, Bcl-2, cleaved-caspase 3 and Survivin, along with the proliferation rate separatelyin the PCs and in the rest tumor area in a series of CLL/SLL patients, focusingon the differences in expression between the two compartments andcorrelating their expression with several clinicopathological and biologicalcharacteristics of our patients. This is a study of 50 patients fulfilling thediagnostic criteria of CLL/SLL (48 pts with CLL, 2 with SLL) according toNational Cancer Institute-sponsored working Group guidelines and the 2008World Health Classification of Tumours of Hematopoietic and LymphoidTissue for whom archival primary tissue material at diagnosis (25 cases) or atleast prior to treatment initiation (25 cases), was available. The specimenanalyzed was lymph node in 44 cases, spleen in 5 and skin in one case. Ouranalysis was performed in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Thepresence and size of PCs was evaluated in haematoxylin and eosin (HE)sections. Proliferation status was assessed by the Ki-67 proliferation indexwhile the apoptotic process was studied by evaluating the aforementionedmolecules by immunohistochemistry using proper monoclonal antibodies.Ourstudy showed that Fas, FasL and c-FLIP were observed both in the PCs andin the non-PC areas practically in all cases with cytoplasmic localization . However only the difference in FasL expression between the PC and the non–PC areas attained statistical significance (p: 0,0107)Survivin expression was observed in all cases mainly in the cytoplasm with 17cases (34%) showing also nuclear localization. Moreover, median survivinexpression in the PCs (60%) was higher compared to the non-PC areas(37,5%), (p<0,0001). Our study also disclosed that c-caspase 3 wasexpressed in very low levels both in PCs and non -PCs areas while the bcl-2protein was expressed in high levels in all cases both in PCs and in non PCareas. FasL expression in the PCs was positively correlated with Fas and c-FLIP in the same areas while higher c-FLIP expression in the PCs areas wasaccompanied with higher survivin in the same areas. Fas expression in thePCs was positively associated with CD38 expression, FasL expression wascorrelated with B-symptoms and elevated β2-microglobulin, c-FLIPimmunoreactivity was higher in cases that displayed increased ZAP-70expression and survivin expression was correlated with advanced Binet stageas well as with the presence of bulky lymphadenopathy. Univariate analysisdemonstrated that concurrent overexpression of Fas/FasL/c-FLIP in the PCswas related to decreased DFS (p:0,0097) and OS (p:0,0424) as well as thatconcurrent overexpression of Fas/FasL/survivin in the PCs was related withdecreased DFS (p:0,0269). Additionally, multivariate analysis demonstratedthat concurrent overexpression of Fas/FasL/c-FLIP in the PCs was correlatedwith worse outcome for DFS (p:0,008) as well as for OS (p:0,042).Inconclusion, in this study, we have explored for the first time the expression ofFas, FasL, c-FLIP,bcl-2, c-caspase 3 and survivin in lymph nodes and spleeninvolved by CLL and demonstrated differences between the proliferativecompartment of the tumour represented by the PCs and the remaining tumorcompartment. Moreover, we have analysed the reciprocal interactions amongapoptotic markers within the PCs and made an effort to investigate themechanisms involved in the regulation of the apoptotic process in this tumourarea. Our results support the suspected involvement of c-FLIP as amechanism to counteract apoptosis driven by Fas/FasL coexpression andsuggest that survivin may act as a redundant anti-apoptotic mechanism in thisregard. More importantly, the data presented in this study directly implicateconcurrent Fas/FasL and c-FLIP overexpression in the PCs as a contributor to patients’ survival, conveying independent prognostic information in addition tothat obtained by standard prognosticators.

Η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ) θεωρείται ότι προκαλείται κυρίωςαπό διαταραχές του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (απόπτωση),λόγω του γεγονότος ότι χαρακτηρίζεται από σταδιακή συσσώρευση μικρώννεοπλασματικών ώριμων Β κυττάρων με μακρό χρόνο επιβίωσης, τα οποίαβρίσκονται στη φάση Go ή στην πρώιμη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου.Ιδιαίτερο ιστολογικό χαρακτηριστικό της αποτελούν τα κέντραπολλαπλασιασμού (ΚΠ), τα οποία αναδεικνύονται κυρίως σε λεμφαδενικό ιστόκαι αποτελούνται από προλεμφοκύτταρα και παρανοσοβλάστες. Η σύγχρονηβιβλιογραφία προτείνει ότι τα ΚΠ στην ΧΛΛ παίζουν σημαντικό ρόλοαποτελώντας το πολλαπλασιαστικό διαμέρισμα του νεοπλάσματος.Τομονοπάτι Fas ⁄ FasL διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην διεκπεραίωση τηςαπόπτωσης. Το Fas (CD95 ⁄ APO-1) και ο Fas συνδέτης (FasL ⁄CD178) είναιμόρια επιφανείας της υπεροικογένειας του παράγοντα νέκρωσης των όγκων(TNF). Τόσο τα φυσιολογικά όσο και τα νεοπλασματικά κύτταρα εκφράζουνFas, ενώ ο FasL εκφράζεται κυρίως από τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα.Μετά από τη σύνδεση του FasL με το Fas, τα νεοπλασματικά κύτταραυφίστανται απόπτωση.Τα νεοπλασματικά κύτταρα αποκτούν μηχανισμούςπροκειμένου να διαφύγουν την διαμεσολαβούμενη από το Fas απόπτωση.Μεταξύ αυτών η έκφραση μορίων, όπως το C-FLIP και η survivin κατέχουνπρωτεύοντα ρόλο. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε βιοπτικό υλικό πουπεριελάμβανε λεμφαδένες, σπλήνες και δέρμα από ασθενείς πουδιαγιγνώσθηκαν με ΧΛΛ με βάση γνωστά κριτήρια. Έγινε ιστολογικήπεριγραφή των ευρημάτων σε χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης, με παράλληλημορφολογική περιγραφή των ευρημάτων των αντίστοιχων επιχρισμάτωναίματος σε χρώση May-Grunwald-Giemsa. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκεανοσοϊστοχημικός έλεγχος για τα ακόλουθα μόρια: Fas, FasL, c-FLIP, survivin,ενεργοποιημένη κασπάση- 3, Bcl-2 και Ki-67. Η ανοσοϊστοχημική έκφρασητων μορίων αυτών αξιολογήθηκε ξεχωριστά εντός των ΚΠ και εκτός αυτών μεστόχο να ανευρεθούν τυχόν διαφορές ανάμεσα στα δύο αυτά διαμερίσματατου νεοπλάσματος. Αναζητήθηκαν τυχόν συσχετίσεις των υπό μελέτη μορίων ,καθώς και συσχετίσεις με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους (μεταξύτων οποίων συμπεριλήφθηκαν και η έκφραση των ZAP-70 και CD38) αλλά και με την επιβίωση των ασθενών. Τα ΚΠ ήταν εμφανή σε όλα ταπαρασκευάσματα εκτός από τη βιοψία δέρματος με το μέγεθος τους ναποικίλει. Σε 17 περιστατικά (13 λεμφαδένες και 4 σπλήνες ) η μέγιστηδιάμετρός τους ξεπερνούσε τη διάμετρο ενός πεδίου Χ20 και σύμφωνα με τηβιβλιογραφία θεωρήθηκαν ότι ήταν διευρυσμένα. Η παρουσία διευρυσμένωνΚΠ, ωστόσο, δεν συσχετίστηκε με τις κλινικοπαθολογοανατομικέςπαραμέτρους και την επιβίωση των ασθενών.Ο δείκτης κυτταρικού πολλαπλασιασμού Ki-67 ήταν σημαντικά υψηλότεροςστα ΚΠ σε σχέση με το υπόλοιπο νεόπλασμα (p= 0.0001).Η διάμεσος τιμή της έκφρασης των Fas, FasL και c-FLIP ήταν υψηλότερηστα ΚΠ σε σχέση με τις περιοχές εκτός αυτών (50%, 30% και 50% αντίστοιχαστα ΚΠ και 40%, 10% και 40% εκτός των ΚΠ). Ωστόσο μόνο η διαφορά πουπαρατηρήθηκε στην έκφραση του FasL ήταν στατιστικά σημαντική (p=0.0107).Στα μισά περιστατικά η έκφραση της survivin ήταν υψηλότερη στα ΚΠ σεσχέση με το υπόλοιπο νεόπλασμα (60% στα ΚΠ και 37.5% στο υπόλοιπο,p<0.0001)Η ενεργοποιημένη (c-) caspase 3 εκφράζονταν σε πολύ χαμηλά επίπεδατόσο εντός όσο και εκτός των ΚΠ έχοντας ένα εύρος τιμών από 0.05% έως16% (διάμεσος τιμή : 0.5%), χωρίς να παρατηρείται διαφορά μεταξύ των δύοδιαμερισμάτων του νεοπλάσματος.Στην πλειοψηφία των περιπτώσεων (39/50, 78%) η έκφραση του Bcl-2ανιχνεύθηκε τόσο στα ΚΠ όσο και εκτός. Ωστόσο, σε 10 περιστατικάπαρατηρήθηκε ελαττωμένη έντασης έκφραση του Bcl-2.Συνέκφραση του Fas και του FasL στα ΚΠ παρατηρήθηκε σε 16 (32.65%)περιστατικά, τα περισσότερα εκ των οποίων (11/16, 69%) υπερέκφραζανεπίσης c-FLIP.Η έκφραση του FasL στα ΚΠ σχετίστηκε θετικά με την έκφραση των Fas και c-FLIP στις ίδιες περιοχές (R= 0.3570, p=0.018 για το Fas και το FasL, R=0.3445, p=0.0154 για το FasL και το c- FLIP). Ακόμη, η έκφραση των Fas καιFasL στα ΚΠ σχετίστηκε με υψηλότερες τιμές Ki67 (p=0.0452 και p=0.0365 αντίστοιχα ) και ελαττωμένη έκφραση του Bcl-2 στις ίδιες περιοχές (p= 0.005για το Fas και p=0.054 και το FasL).Η υπερέκφραση του c-FLIP σχετίστηκε με υψηλότερη έκφραση της survivinστα ΚΠ (p= 0.017).Η έκφραση c-caspase 3 ήταν οριακά υψηλότερη στα περιστατικά πουεμφάνιζαν υψηλότερη έκφραση του Fas στα ΚΠ (R= 0.3987, p=0.0041).Η έκφραση της survivin στα ΚΠ σχετίστηκε οριακώς με το στάδιο νόσου κατάBinet (p=0.074)Η ταυτόχρονη υπερέκφραση των Fas/FasL και c-FLIP στα ΚΠ σχετίστηκε μεελαττωμένη συνολική επιβίωση (OS) και επιβίωση ελέυθερης νόσου (DFS)τόσο στη μονοπαραγοντική (p=0.0424 για την OS και p=0.0097 για την DFS),όσο και στην πολυπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης (p=0.042 για την OS καιp=0.008 για την DFS), ενώ η ταυτόχρονη υπερέκφραση των Fas/FasL καιsurvivin στα ΚΠ σχετίστηκε με ελαττωμένη επιβίωση ελεύθερης νόσου (DFS)στη μονοπαραγοντική (p=0.0269), ενώ κατά την πολυπαραγοντική ανάλυσηείχε μόνο οριακή στατιστική σημαντικότητα.Συμπερασματικώς, η υπερέκφραση του FasL στα ΚΠ αποτελεί ένδειξη ότι τανεοπλασματική κύτταρα έχουν αποκτήσει αυτόν τον μηχανισμό για ναδιαφύγουν της ανοσοεπιτήρησης.Η θετική σχέση που αναδεικνύεται μεταξύ c-FLIP και FasL στα ΚΠυποδηλώνει ότι η έκφραση του c-FLIP μπορεί να αποτελεί ένα σημαντικόμηχανισμό με το οποίο τα νεοπλασματικά κύτταρα διαφεύγουν από τηναπόπτωση στο διαμέρισμα αυτό, ενώ η ταυτόχρονη υπερέκφραση survivin καιc-FLIP στα ΚΠ υποδεικνύει ότι η survivin μπορεί να αποτελεί έναν επιπλέονμηχανισμό διαφυγής από την απόπτωση στο συγκεκριμένο διαμέρισμαΤα χαμηλά επίπεδα έκφρασης της c-caspase 3 επιβεβαιώνουν ότι η ΧΛΛ είναινεόπλασμα με χαμηλό αποπτωτικό δυναμικό.Η έκφραση της c-caspase 3, ενώ σχετίστηκε σημαντικά με την έκφραση τουFas δε συσχετίστηκε με την έκφραση των FasL, c-FLIP, survivin και Bcl-2γεγονός που ενδεχομένως αντανακλά τους πολύπλοκους μηχανισμούς πουσυμμετέχουν στη ρύθμιση της αποπτωτικής διαδικασίας στη ΧΛΛ. Η σχέση της έκφρασης της survivin με το στάδιο Binet την καθιστά υποψήφιο για τησυμμετοχή στους μηχανισμούς απόκτησης επιθετικού φαινοτύπου.Ηανεξάρτητη σχέση της ταυτόχρονης υπερέκφρασης των Fas/FasL και c-Flipμε την επιβίωση των ασθενών αποτελεί σημαντική ένδειξη ότι ενδέχεταιί νααποτελέσει ένα επιπλέον στοιχείο που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί γιατην κατάταξη των ασθενών με βάση την πρόγνωση, παρέχοντας επιπλέονπληροφορία από αυτήν που προκύπτει από τους κλασσικούς προγνωστικούςπαράγοντες.