Treatment effect on the expression of podocyte proteins in systemic lupus erythematosus nephritis

Abstract

Renal epithelial cells (podocytes) and their slit diaphragms (SD) that cover the slit pores among adjacent foot processes (FP) of the podocytes are crucial constituent of the primary barrier for ultrafiltration of plasma in renal glomeruli. They ensure the integrity of the glomerular basement membrane (GBM) and prevent the urinary loss of proteins. A putative distraction of the SDs, of its main components, nephrin and podocin is involved in the immune mediated glomerulonephritis. We have previously reported that decreases of the podocyte SD proteins nephrin and podocin represent early events in the podocytopathy of lupus nephritis (LN). The latter is a prototype of autoimmune disease with a various histological and clinical picture with proteinuria been a major clinical manifestation. We asked whether immunosuppressive agents such as glucocorticoids (GC) and cyclophosphamide (CY), may have direct effects on SD and subsequently on podocytes. We used NZB/W F1 female mice in our experiments. NZB/W are thought to be a representative model of spontaneous development of LN. Animals were divided in groups of 6 and 9 months old, as well as in groups of: a) untreated (control) mice (n = 24), b) GC–treated mice, which received dexamethasone p.o. for 3 (n = 4) or 6 (n = 5) consecutive months, and c) CY–treated mice, which received CY i.p. for 3 (n = 4) or 6 (n = 4) consecutive months. C57Bl/6 mice (n = 20) were used as normal controls. Comparisons were made with the parental strains of NZB (n = 5) and NZW (n = 4) as well. Assessment of 24h proteinuria was made by Bradford assay. After mice were euthanized tissue from the left kidney was used for histologic studies: light microscopy, IgG immunofluorescence and electron microscopy. Right kidney was used for biochemical studies: glomerular expression of nephrin and podocin in the protein level was studied with western blot. Nephrin expression in kidney tissue was also examined with immunofuorescence. To determine whether changes in nephrin and podocin expression in NZB/W treated mice correlate with altered transcription in corresponding genes, we performed quantitative real-time PCR. Finally, anti-dsDNA antibodies in mice serum was examined with ELISA. Data are expressed as the mean ± standard error of the mean (SEM) values. Comparisons were performed with the Mann-Whitney U test for numerical data. The Spearman’s rho (ρ) test was used for correlation analysis. Treatment of NZB/W mice with GC or CY prevented the development of proteinuria, whereas untreated littermates developed overt proteinuria by the age of 6 months. Three-month-old NZB/W mice demonstrated normal histology or findings of mild mesangial LN (MMLN) in light microscopy. In contrast, all untreated 6- and 9-month-old mice developed focal or diffuse proliferative glomerulonephritis (FPLN and DPLN, respectively) associated with numerous IgG deposits. In GC– and CY–treated mice, glomerulonephritis was milder with markedly reduced interstitial inflammation and mesangial hyperplasia; seven out of eight (7/8) NZB/W mice treated for 6 months had normal LM histology. Accordingly, IgG kidney deposition was significantly reduced in treated mice being undetectable in mice treated with CY for 6 months. Electron microscopy examination of kidney sections from untreated 6- and 9-month-old mice with FPLN or DPLN revealed extensive mesangial, subendothelial, and subepithelial EDD fusion of podocytes and effacement of FPs, and destruction of slit diaphragms. Conversely, in mice treated with GC or CY, there were only few sub-endothelial EDD. Both SD and podocytes FPs and SD were well preserved. Next the glomerular expression of the main SD proteins was examined with western blot. Nephrin was increased in treated mice compared to untreated littermates both in GC and CY groups (p<0,05). Glomerular nephrin expression showed negative association with the histological class of nephritis (ρ=-0.69, p<0.001), and positive association with podocin protein levels (ρ=0.53, p=0.007). Treatment of NZB/W mice for 3–6 months resulted also in higher glomerular podocin protein levels compared to untreated aged-matched mice with FPLN or DPLN. Similar to nephrin, podocin levels correlated inversely with the histological class of nephritis (ρ=-0.62, p=0.001). Nephrin expression and localization was further assayed by IF in kidney sections from NZB/W mice. In accordance with the WB results, nephrin IF staining was stronger in treated mice which was reduced in older untreated mice with FPLN or DPLN, and became diminished in 9-month-old diseased mice. Nephrin IF score correlated with the nephritis histological class (ρ=0.55, p=0.008) and nephrin expression assayed by WB (ρ=0.71, p=0.004). To determine whether changes in nephrin and podocin expression in NZB/W treated mice correlate with altered transcription in corresponding genes, we performed quantitative real-time PCR in total RNA. Nephrin mRNA was significantly increased after 3–6 of GC and CY therapy compared to age-matched untreated littermates (p<0,05 in the GC group and p<0,01 in the CY group). Podocin mRNA levels was increased in treated mice but differences were statistically significant only after 6 months of treatment. We observed a significant correlation between nephrin and podocin mRNA both in untreated (ρ=0.67, p=0.005, n = 16) and in GC / CY-treated (ρ=0.72, p=0.002, n = 16) mice. Next, we addressed whether electron microscopy findings in kidney biopsies correlated with differential expression of SD proteins. Indeed, electron dense deposits showed significant inverse correlation with glomerular nephrin (ρ correlation coefficient ranging from -0.75 to -0.85) and podocin (ρ ranging from -0.88 to -0.93) protein expression. Similarly, podocyte FP effacement showed negative association with both nephrin (ρ = -0.77, p = 0.009) and podocin (ρ= -0.93, p < 0.001). With respect to mRNA levels, deposits of any type and podocyte FP effacement showed also inverse association with nephrin – but not podocin – expression. We also examined the SD protein expression and their mRNA levels in treated mice compared to normal controls and their parental strains. Our results present the effect of early treatment of LN on podocytes SD proteins. Treatment with GC or CY prevented the development of proteinuria, and halted the histologic alterations in light and electron microscopy, where deposits of any type were diminished and podocytes structure was preserved. Glomerular nephrin and podocin expression significantly increased in both treated groups up to normal levels. Nephrin immunofluorescence confirmed these results. The findings above and the increased mRNA levels may imply that the SD alterations at the protein level precede the alterations in the mRNA level. The previous results are confirmed by the correlation of SD proteins with the histologic findings. Podocytopathy may be due to immunological mechanisms that involve elements of both the innate and adaptive immunity (CD8+ T cells, anti-dsDNA antibodies, co-stimulatory molecules such as B7-1 and Toll-like receptors). Immunosuppressive agents, in addition to the effect on the immune system, may directly influence the unique structure and function of podocytes. Our findings further emphasize the role of podocytes and the slit diaphragm in the pathogenesis of immune-mediated glomerulonephritis, and point toward the potential benefits of development of selective, antiproteinuric, and podocyte-protective drugs.

Τα επιθηλιακά κύτταρα των νεφρικών σπειραμάτων (ποδοκύτταρα) και οι λεπτές μεμβράνες των σχισμών διήθησης (ΛΜ) που γεφυρώνουν τους πόρους μεταξύ των γειτονικών ποδοειδών προσεκβολών (ΠΠ) των ποδοκυττάρων αποτελούν σημαντικά στοιχεία του φραγμού της υπερδιήθησης του πλάσματος στα νεφρικά σπειράματα. Διασφαλίζουν έτσι την ακεραιότητα της βασικής μεμβράνης και εμποδίζουν την απώλεια πρωτεϊνών στα ούρα. Βλάβη των ΛΜ και κυρίως των σημαντικότερων συστατικών τους, νεφρίνη και ποδοσίνη, εμπλέκεται σε σπειραματονεφρίτιδες ανοσολογικής αρχής. Έχουμε πρόσφατα αναφέρει ότι ελάττωση αυτών των πρωτεϊνών των ΛΜ αποτελεί πρώιμο γεγονός στην «ποδοκυττοπάθεια» της νεφρίτιδας του λύκου (ΝΛ). Η τελευταία αποτελεί πρότυπο αυτοάνοσου νοσήματος με ποικίλη ιστολογική και κλινική εικόνα με την πρωτεϊνουρία να αποτελεί την κυριότερη κλινική εκδήλωση. Διενεργήσαμε μία μελέτη με πειραματόζωα προκειμένου να εξετάσουμε κατά πόσο η ανοσοκατασταλτική θεραπεία με κορτικοειδή και κυκλοφωσφαμίδη, μπορεί να έχει άμεση επίδραση στις πρωτεϊνες των ΛΜ και κατ’επέκταση στα ποδοκύτταρα. Ως πειραματόζωα χρησιμοποιήθηκαν θηλυκά ποντίκια NZB/W F1. Τα NZB/W αναφέρθηκε προηγούμενα ότι θεωρούνται το πιο αντιπροσωπευτικό μοντέλο αυθόρμητης εκδήλωσης της ΝΛ. Τα πειραματόζωα χωρίστηκαν σε ομάδες ηλικίας έξι και εννέα μηνών και επίσης σε ομάδες ανάλογα με το αν έλαβαν ή όχι κορτικοειδή p.o ή ώσεις κυκλοφωσφαμίδη i.p. για 3 ή 6 μήνες αντίστοιχα. Επίσης χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια C57Bl/6 ως φυσιλογικοί μάρτυρες. Τέλος συγκρίσεις έγιναν και με τους προγόνους των NZB/W , δηλ. τα ποντίκια NZB και NZW. Η πρωτεϊνουρία 24ώρου προσδιορίσθηκε με τη μέθοδο Bradford. Μετά την ευθανασία των πειραματόζωων απομονώθηκε ο αριστερός νεφρός για ιστολογική μελέτη: φωτονικό μικροσκόπιο, ανοσοφθορισμός IgG και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Αντίθετα ο δεξιός νεφρός απομονώθηκε για μοριακή και βιοχημική μελέτη: η σπειραματική έκφραση της νεφρίνης και ποδοσίνης σε πρωτεϊνικό επίπεδο μελετήθηκε με western blot, ενώ η έκφραση της νεφρίνης εξετάστηκε επίσης με ανοσοφθορισμό στα παρασκευάσματα νεφρικού ιστού. Για να προσδιοριστεί αν οι μεταβολές της νεφρίνης και ποδοσίνης οφείλονται σε μεταβολή της μεταγραφής των αντίστοιχων γονιδίων προσδιορίσαμε το mRNA τους με ποσοτική αντίστροφη real time PCR στα ίδια δείγματα. Τέλος με ELISA μετρήθηκαν και τα επίπεδα anti-DNA του ορού των ποντικών. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). Για τις συγκρίσεις χρησιμοποιήθηκαν οι έλεγχοι Mann-Whitney U-test (αριθμητικές μεταβλητές) και το Fischer’s exact test (κατηγορικές μεταβλητές).Το Spearman’s rho (ρ) test χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση συσχετίσεων. Η θεραπεία με κορτικοειδή ή κυκλοφωσφαμίδη εμπόδισε την ανάπτυξη πρωτεϊνουρίας στα NZB/W ποντίκια, ενώ τα αντίστοιχα μη θεραπευμένα εμφάνισαν από την ηλικία των 6 μηνών νεφρωσικού επιπέδου πρωτεϊνουρία. Στο επίπεδο του φωτονικού μικροσκοπίου τα ζώα μάρτυρες 3 μηνών είχαν φυσιολογική ιστολογική εικόνα ή ήπια μεσαγγειακή υπερπλασία (ΗΜΝΛ), ενώ τα 6-9 μηνών εμφάνισαν όλα εστιακή ή διάχυτη υπερπλαστική ΝΛ (ΕΥΝΛ και ΔΥΝΛ αντίστοιχα) με άφθονες IgG εναποθέσεις. Τα θεραπευμένα είχαν ηπιότερη εικόνα από τους 3 μήνες θεραπείας (ηλικίας 6 μηνών), ενώ στους 6 μήνες θεραπείας (9μηνών) 7/8 είχαν φυσιολογική ιστολογική εικόνα. Οι εναποθέσεις IgG μειώθηκαν από τους 3 μήνες θεραπείας μέχρις μη ανίχνευσή τους στους 6 μήνες θεραπείας. Η εξέταση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο των ποντικών-μαρτύρων με ΕΥΝΛ και ΔΥΝΛ κατέδειξε εκτεταμένες μεσαγγειακές, υπενδοθηλιακές και υποεπιθηλιακές εναποθέσεις με συνοδό ποδοκυττοπάθεια (επιπέδωση των ποδοκυττάρων και εξάλειψη των ποδικών εκβλαστήσεων). Αντίθετα τα πειραματόζωα που έλαβαν θεραπεία είχαν ελάχιστες υπενδοθηλιακές εναποθέσεις, ενώ τα ποδοκύτταρα και οι ΛΜ διατηρούνταν φυσιολογικές. Η μελέτη της σπειραματικής έκφρασης των κύριων πρωτεϊνών των ΛΜ με western blot έδειξε αύξηση των επιπέδων νεφρίνης στα ζώα με θεραπεία σε σχέση με τους μάρτυρες χωρίς θεραπεία (p<0,05) και για την ομάδα με κορτικοειδή και για αυτή με κυκλοφωσφαμίδη. Επίσης η έκφραση της νεφρίνης είχε αρνητική συσχέτιση με την ιστολογική τάξη της ΝΛ (ρ= -0,69, p<0,001) και θετική συσχέτιση με τα επίπεδα της ποδοσίνης (ρ= 0,53, p=0,007). Η θεραπεία με κορτικοειδή ή κυκλοφωσφαμίδη για 3-6 μήνες εμφάνισε επίσης υψηλότερα επίπεδα σπειραματικής έκφρασης ποδοσίνης σε σχέση με ζώα ίδιας ηλικίας με ΕΥΝΛ και ΔΥΝΛ που δεν έλαβαν θεραπεία. Αντίστοιχα με τη νεφρίνη τα επίπεδα της ποδοσίνης συσχετίστηκαν αντίστροφα με την ιστολογική κατάταξη της ΝΛ (ρ= -0,62, p<0,001). Η νεφρίνη περαιτέρω εκτιμήθηκε με ανοσοφθορισμό νεφρικών ιστών των NZB/W ποντικών. Σύμφωνα και με τα αποτελέσματα των western blot η ένταση της χρώσης της νεφρίνης αυξήθηκε στα ζώα με θεραπεία, ενώ στα μη θεραπευμένα ζώα με ΕΥΝΛ και ΔΥΝΛ 6 μηνών ήταν μειωμένη και εντελώς απούσα στα ζώα ηλικίας 9 μηνών. Επιπλέον η ένταση της χρώσης της νεφρίνης συσχετίστηκε με την ιστολογική τάξη (ρ=0,55, p=0,008) και με την western blot (ρ= 0,71, p=0,004). Για να καταδειχθεί αν η έκφραση των πρωτεϊνών σχετίζεται με μεταβολή της μεταγραφής των αντίστοιχων γονιδίων προσδιορίσθηκε το mRNA νεφρίνης των θεραπευμένων ποντικών για 3-6 μήνες και ήταν σημαντικά αυξημένο σε σχέση με τους μάρτυρες (p<0,05 για την ομάδα των κορτικοειδών και p<0,01 για την ομάδα της κυκλοφωσφαμίδης). Το mRNA της ποδοσίνης ήταν αυξημένο ήδη από τους 3 μήνες θεραπείας αλλά στατιστικά σημαντικά μόνο μετά από 6 μήνες θεραπείας. Παρατηρήθηκε επίσης συσχέτιση μεταξύ του mRNA της νεφρίνης και της ποδοσίνης και στους μάρτυρες (ρ=0.67, p=0.005, n = 16) αλλά και στα θεραπευμένα ζώα (ρ=0.72, p=0.002, n = 16). Έπειτα προσδιορίσθηκαν πιθανές συσχετίσεις των ευρημάτων του ηλεκτρονικού με την έκφραση των πρωτεϊνών. Πράγματι, βρέθηκε αρνητική συσχέτιση των εναποθέσεων με τη νεφρίνη (ρ από -0.75 ως -0.85, p<0,013) και την ποδοσίνη (ρ από -0.88 ως -0.93, p<0,013). Ομοίως η εξάλειψη των ποδικών εκβλαστήσεων συσχετίστηκε αρνητικά και με τη νεφρίνη (ρ = -0.77, p = 0.009) και με την ποδοσίνη (ρ= -0.93, p<0,001). Σχετικά με τα επίπεδα mRNA οι εναποθέσεις κάθε τύπου και η εξάλειψη των ποδικών εκβλαστήσεων είχαν αρνητική συσχέτιση με τη νεφρίνη, αλλά όχι με την ποδοσίνη. Επίσης εξετάστηκε η έκφραση των πρωτεϊνών των ΛΜ καθώς και τα επίπεδα mRNA στα θεραπευμένα ζώα σε σχέση με φυσιολογικούς μάρτυρες, αλλά και με τα προγονικά στελέχη τους. Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν την επίδραση της πρώιμης θεραπείας της ΝΛ στις κύριες πρωτεϊνες των ΛΜ των ποδοκυττάρων. Η θεραπεία με κορτικοειδή ή κυκλοφωσφαμίδη εμπόδισε την ανάπτυξη πρωτεϊνουρίας, αλλά και τις ιστολογικές αλλοιώσεις τόσο με το φωτονικό, όσο και με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο όπου μειώθηκαν οι κάθε τύπου ανοσοεναποθέσεις και διατηρήθηκε η δομή των ποδοκυττάρων. Η σπειραματική έκφραση της νεφρίνης και της ποδοσίνης αυξήθηκαν σημαντικά στα ζώα με θεραπεία ως το επίπεδο των φυσιολογικών μαρτύρων, ενώ το ίδιο επιβεβαίωσε για τη νεφρίνη η μελέτη με ανοσοφθορισμό. Τα παραπάνω ευρήματα σε συνδυασμό με την αύξηση των επιπέδων mRNA των πρωτεϊνών κυρίως στη μεγαλύτερη διάρκεια θεραπείας πιθανά υποδηλώνουν ότι οι αλλαγές στις ΛΜ συμβαίνουν πρώτα σε επίπεδο πρωτεϊνης και ακολούθως σε επίπεδο μεταγραφής της. Τα παραπάνω επιβεβαιώνονται και από την συσχέτιση των πρωτεϊνών με τα ιστολογικά ευρήματα. Η ποδοκυττοπάθεια πιθανά οφείλεται σε ανοσολογικούς μηχανισμούς όπου εμπλέκονται στοιχεία της φυσικής, αλλά και της επίκτητης ανοσίας (CD8+ T-κύτταρα, αντι-DNA αντισώματα, συνδιεγερτικά μόρια όπως το Β7-1 και οι υποδοχείς TLR). Η ανοσοκατασταλτική θεραπεία που χρησιμοποιήθηκε πέρα από την επίδραση στο ανοσολογικό σύστημα πιθανά επιδρά άμεσα στη δομή και λειτουργία των ποδοκυττάρων. Τα αποτελέσματά μας τονίζουν περαιτέρω το ρόλο των ποδοκυττάρων και των πρωτεϊνών των ΛΜ σε ανοσολογικής αρχής σπειραματονεφρίτιδες και αναδεικνύουν τα πιθανά οφέλη της ανάπτυξης εκλεκτικών, προστατευτικών για τα ποδοκύτταρα θεραπειών.