Expression of programmed death-1 (PD-1) and PD-1 ligands in human and murine tissue and their role in immunological tolerance: genetic, immunologic and immunohistochemical analysis of the PD-1/PD-L1 pathway in human systemic lupus erythematosus

Abstract

The immune system has evolved to protect the body from foreign invading pathogens. To accomplish this critical role, T lymphocytes must discriminate between self and non-self; this property translates into immune recognition and elimination of infectious invaders while leaving host tissues intact. This highly selective process occurs through several complicated mechanisms. The first step is the elimination of self-reactive cells during T cell development in the thymus, aiming at a T cell repertoire that is ‘self-tolerant’. However, this process is incomplete and autoreactive T cells that escape ‘central’ tolerance are controlled by peripheral mechanisms (‘peripheral’ tolerance). Autoimmunity results when either central or peripheral mechanisms fail. Among the mechanisms involved in safeguarding of self-tolerance, B7/CD28 membrane receptors are crucial for fine-tuning of T cell function. Programmed death-1 (PD-1) is an inhibitory lymphocyte receptor that has recently emerged as a key player in induction and maintenance of tolerance. Compared to other B7 receptors, PD-1 has a broader role in regulation of immune responses considering its expression on activated T- and B-lymphocytes, the wide expression pattern of its ligands (PD-L1, PD-L2) on both lymphoid and non-lymphoid parenchymal cells, and its distinct mechanism of action. The role of PD-1 in tolerance is further highlighted by findings in PD-1-deficient mice which develop strain-specific autoimmune phenotypes, and in chronic viral infections which correlate with upregulation of PD-1 on virus-specific ‘exhausted’ T cells. In humans, a possible role for PD-1 in immune regulation is indicated by genetic-association studies which have shown certain polymorphisms of the PD-1 gene to confer increased risk for various autoimmune diseases. We sought to examine the role of PD-1 and PD-1 ligands in regulation of T cell function in systemic lupus erythematosus (SLE), the prototype of autoimmune disorder. SLE is characterized by hyper-active T cells and aberrant T cell mediated autoantibody production and end-organ tissue injury. We first performed PCR-based restriction fragment length analysis in 289 SLE patients and 256 matched healthy controls and confirmed the previously reported association with the PD1.3 (+7146G/A) single nucleotide polymorphism (SNP) (risk A allele associated with odds ratio 2.23 [95% confidence interval 1.55– 3.38] for SLE). PD1.3 resides in an enhancer-like domain in intron 4 of the PD-1 gene, and the A allele has been shown to disrupt a RUNX1 binding site. To address the putative regulatory effects of PD1.3 SNP in PD-1 transcription, we performed transient transfection experiments in Jurkat T cells with reporter constructs expressing the firefly luciferase gene under the control of the SLE-associated A allele or the wild-type G allele of PD1.3. Over-expression of RUNX1 resulted in increased luciferase activity that was significantly higher with the G allele than with the A allele (by 36 ± 4%), indicating that PD1.3A may alter PD-1 expression. Indeed, two SLE patients homozygous for PD1.3 (A/A) had diminished PD-1 expression, assessed by flow cytometry, on peripheral blood CD4⁺ CD25⁺, CD4⁺ CD69⁺ and CD4⁺ HLA-DR⁺ T cell subsets compared to heterozygous (G/A) and wild-type (G/G) SLE patients. PD1.3 A/A patients also had defective induction of PD-1 on activated CD4⁺ T cells following activation with suboptimal –but not optimal– concentration of anti-CD3/anti-CD28 antibodies, associated with impaired PD-1–mediated suppression of T cell proliferation and IFN-γ production under suboptimal concentrations of PD-L1.Fc. To further characterize the role of PD-1 in regulation of immune responses in the context of SLE, we performed autologous mixed lymphocyte reaction (AMRL) experiments, which is an ex vivo model of autoreactivity against apoptotic self-antigens. During AMLR, regulatory circuits suppress effector T cells, and only a small degree of cell proliferation ensues. Compared to healthy controls, SLE patients had defective induction of PD-1 on AMLR CD4⁺ CD25⁺ and CD4⁺ CD69⁺ T cells; abnormalities were more pronounced in patients carrying the PD1.3A polymorphism. In contrast, PD-L1 expression on AMLR CD14+ monocytes was comparable between SLE patients and healthy controls. In accordance, blockade of PD-1/PD-L1 interactions with monoclonal antibodies caused significant increase in AMLR T cell proliferation in healthy controls but not in SLE patients. 5 Since PD-1 is involved in regulation of effector T cells at the site of inflammation through interaction with PDL1- expressing activated parenchymal cells, we examined the expression of PD-1/PD-L1 in renal biopsy samples from patients with lupus nephritis by immunohistochemistry. Weak-to-moderate PD-1 staining was detected in the glomeruli in 8 of 13 samples (62%) from patients with lupus nephritis compared with 0 of 9 (0%) control samples; PD-1 expression correlated with CD3 T cell staining. PD-L1 was detected in the renal tubules of both SLE patients (10 of 15, 67%) and controls (5 of 9, 56%), indicating a potential role for PD- 1/PD-L1 in regulation of local immune inflammatory responses in SLE patients. Despite its expression in the peripheral blood and inflamed tissues of SLE patients, the PD-1/PD-L1 pathway could be adversely affected by the lupus inflammatory microenvironment. To test this hypothesis, purified CD4+ T cells from healthy controls were cultured in serum from non-homologous controls or active SLE patients and the effect of PD-1 crosslinking on T cell proliferation was assessed. At suboptimal PD-1 activation, incubation with SLE serum resulted in decreased suppression of T cell proliferation compared with normal serum (6.7 ± 3.6% versus 16.3 ± 2.7%); optimal PD-L1.Fc concentrations were able to overcome this effect and resulted in profound SLE T cell inhibition. In summary, this study provides circumstantial evidence for an important role for the inhibitory PD-1/PD-L1 pathway in regulation of T cell function in human SLE. Importantly, our experiments indicate aberrant expression and/or function of PD-1 in lupus as a result of both direct (PD1.3 SNP, AMLR) and indirect (inflammatory microenvironment) effects. The expression of PD-1/PD-L1 in the affected tissues and during AMLR suggests a role of this pathway in maintenance of peripheral T cell tolerance and supports its rationale for its manipulation as a novel therapeutic option in SLE.

Το ανοσολογικό σύστημα των θηλαστικών έχει αναπτυχθεί με στόχο την προστασία του οργανισμού έναντι ξένων παθογόνων μικροοργανισμών. Προϋπόθεση για τη λειτουργία αυτή είναι η δυνατότητα που έχουν τα Τ λεμφοκύτταρα να διακρίνουν τα ξένα αντιγόνα από τα αντιγόνα εαυτού, να αναγνωρίζουν δηλαδή και να αντιμετωπίζουν τους λοιμώδεις μικροοργανισμούς χωρίς να προξενούν βλάβη στον ίδιο τον οργανισμό. Η ιδιότητα αυτή των λεμφοκυττάρων εξασφαλίζεται μέσω σειράς περίπλοκων μηχανισμών που ξεκινούν με τον περιορισμό των αυτοδραστικών Τ λεμφοκυττάρων στο θύμο αδένα. Ωστόσο, ο μηχανισμός αυτός της «κεντρικής» ανοσολογικής ανοχής είναι ατελής με συνέπεια ορισμένοι κλώνοι αυτοδραστικών λεμφοκυττάρων να περνούν στην περιφέρεια όπου και ελέγχονται πλέον από μηχανισμούς «περιφερικής» ανοσολογικής ανοχής. Τυχόν διαταραχή της ανοσολογικής ανοχής (κεντρικής ή περιφερικής) οδηγεί σε αυτοανοσία. Μεταξύ των μηχανισμών περιφερικής ανοσολογικής ανοχής, οι υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης B7/CD28 είναι σημαντικοί για τον έλεγχο της ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων. Ειδικότερα ο υποδοχέας programmed death-1 (PD-1) αναστέλλει τις ανοσολογικές αποκρίσεις των λεμφοκυττάρων και έχει ιδιαίτερο ρόλο στη ρύθμιση της ανοσολογικής ανοχής λόγω κάποιων χαρακτηριστικών που τον διαφοροποιούν από άλλους Β7 υποδοχείς, όπως: η έκφρασή του στα ενεργοποιημένα Τ- αλλά και Β- λεμφοκύτταρα, το ευρύ πρότυπο έκφρασης των υποδοχέων του (PD-L1, PD-L2) σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος αλλά και σε ενεργοποιημένα ιστικά παρεγχυματικά κύτταρα, και ο ειδικός μηχανισμός δράσης. Ο ανοσορρυθμιστικός ρόλος του PD-1 αναδείχθηκε σε μελέτες ποντικών με γενετική απαλοιφή (knock-out) του γονιδίου του PD-1, οι οποίοι αναπτύσσουν ποικίλες αυτοάνοσες διαταραχές, όπως επίσης σε χρόνιες ιογενείς λοιμώξεις όπου διαπιστώνεται ενισχυμένη έκφραση του PD-1 σε αντιγονο-ειδικά Τ λεμφοκύτταρα που βρίσκονται σε ανενεργή («ανοσο-ανεπαρκή») κατάσταση. Στους ανθρώπους, ο πιθανός ρόλος του PD-1 στον έλεγχο των ανοσολογικών αποκρίσεων προέκυψε από μελέτες συσχέτισης πολυμορφισμών του γονιδίου του PD-1 με διάφορα αυτοάνοσα νοσήματα. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, εξετάσαμε το ρόλο του PD-1 και των συνδετών του (PD-1 ligands) στην ρύθμιση της λειτουργίας των Τ λεμφοκυττάρων στο Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (ΣΕΛ), το πρότυπο αυτοάνοσης διαταραχής στον άνθρωπο. Στο ΣΕΛ παρατηρείται υπέρμετρη ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων που καθοδηγούν την παραγωγή αυτοαντισωμάτων από τα Β λεμφοκύτταρα και προκαλούν ιστική βλάβη σε όργανα-στόχους. Εξετάστηκαν 289 ασθενείς με ΣΕΛ και 256 υγιείς εθελοντές για την παρουσία του PD1.3 (+7146G/A) μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού με τεχνική PCR και χρήση ειδικής νουκλεάσης περιορισμού (PCR-based restriction fragment length polymorphism analysis). Διαπιστώθηκε αυξημένη συχνότητα του πολυμορφικού αλληλίου Α στους ασθενείς με ΣΕΛ σε σχέση με τους υγιείς (σχετικός κίνδυνος 2.23, 95% διάστημα εμπιστοσύνης 1.55-3.38). Ο PD1.3 πολυμορφισμός εντοπίζεται σε μια πιθανή ρυθμιστική περιοχή στο intron 4 του γονιδίου PD-1 και το Α αλλήλιο καταργεί μια θέση πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα RUNX1 με πιθανή επίπτωση στη μεταγραφή του γονιδίου. Το ενδεχόμενο αυτό εξετάστηκε με πειράματα μόλυνσης (transfection) Jurkat T κυττάρων με πλασμιδιακές κατασκευές (constructs) που εκφράζουν το γονίδιο luciferase υπό τον έλεγχο του πολυμορφικού Α ή του άγριου τύπου G αλληλίου. Υπερέκφραση του RUNX1 προκάλεσε έκφραση του γονιδίου luciferase η οποία ήταν σημαντικά αυξημένη παρουσία του G σε σχέση με το πολυμορφικό Α αλλήλιο κατά 36 ± 4%, υποδεικνύοντας πιθανή τροποποίηση της έκφρασης του PD-1 παρουσία του PD1.3A πολυμορφισμού. Πειράματα κυτταρομετρίας ροής ανέδειξαν μηδαμινή έκφραση του PD- 1 στην επιφάνεια ενεργοποιημένων CD4⁺ CD25+, CD4+ CD69+ και CD4+ HLA-DR⁺ T λεμφοκυττάρων σε 2 ασθενείς ΣΕΛ ομοζυγώτες για το Α αλλήλιο του PD1.3 (Α/Α), σε σχέση με ετεροζυγώτες (G/A) και άγριου τύπου (G/G) ασθενείς. Επιπλέον, οι PD1.3 A/A ασθενείς παρουσίαζαν μειωμένη έκφραση PD-1 σε CD4⁺ T λεμφοκύτταρα μετά από ενεργοποίηση με χαμηλές –αλλά όχι αυξημένες– συγκεντρώσεις anti-CD3/anti-CD28 αντισωμάτων, και αντιστοίχως μειωμένη δράση του PD-1 ως προς την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της έκκρισης IFN-γ. Για να μελετηθεί περαιτέρω ο ρόλος του PD-1 στις ανοσολογικές αποκρίσεις στο λύκο, πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες Τ λεμφοκυττάρων με αυτόλογα μη-Τ κύτταρα τα οποία είχαν ακτινοβοληθεί ώστε να προκληθεί μικρού βαθμού απόπτωση (autologous mixed lymphocyte rections, AMLR). Οι καλλιέργειες αυτές αποτελούν πειραματικό πρότυπο για τη μελέτη της αυτοδραστικότητας έναντι ιδίων αποπτωτικών αντιγόνων, και κινητοποιούν ρυθμιστικούς μηχανισμούς καταστολής της δράσης των Τ λεμφοκυττάρων. Διαπιστώθηκε μειωμένη έκφραση του PD-1 στα CD4⁺ CD25⁺ και CD4⁺ CD69⁺ T κύτταρα των αυτόλογων καλλιεργειών στους ασθενείς με ΣΕΛ σε σχέση με τους εθελοντές. Επιπλέον, ασθενείς με τον PD1.3A πολυμορφισμό είχαν σημαντικά μειωμένη έκφραση του PD-1. Αντιθέτως, η έκφραση του PD-L1 στα CD14⁺ μονοκύτταρα/μακροφάγα δε διέφερε μεταξύ ασθενών και εθελοντών. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, αποκλεισμός του PD-1/PD-L1 συστήματος με ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα ενίσχυσε τον Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό στις καλλιέργειες από υγιείς εθελοντές αλλά όχι από ασθενείς με ΣΕΛ. Επειδή το PD-1 συμμετέχει στη ρύθμιση των Τ λεμφοκυττάρων στο σημείο της φλεγμονής μέσω αλληλεπίδρασης με ενεργοποιημένα παρεγχυματικά κύτταρα που εκφράζουν PD-L1, θελήσαμε να μελετήσουμε με ανοσοϊστοχημεία την έκφραση του PD-1/PD-L1 σε βιοψίες νεφρού από ασθενείς με νεφρίτιδα του ΣΕΛ. Διαπιστώθηκε σπειραματική έκφραση του PD-1 σε 8 από τα 13 (62%) δείγματα νεφρίτιδας ΣΕΛ, σε σχέση με κανένα από τα 9 (0%) δείγματα υγιούς νεφρικού ιστού. Η έκφραση του PD-1 συσχετίστηκε με αυτή του Τ κυτταρικού δείκτη CD3. Έκφραση του PD-L1 ανιχνεύθηκε στα νεφρικά σωληνάρια ασθενών (10 από 15, 67%) και υγιών (5 από 9, 56%), υποδεικνύοντας συμμετοχή του PD-1/PD-L1 στη ρύθμιση των φλεγμονωδών Τ κυτταρικών αποκρίσεων σε ιστικό επίπεδο. Παρά την έκφραση του PD-1 στο περιφερικό αίμα και τους προσβεβλημένους ιστούς (νεφροί) των ασθενών, η λειτουργία του ανοσορρυθμιστικού συστήματος PD-1/PD-L1 ενδεχομένως να τροποποιείται στο φλεγμονώδες περιβάλλον του λύκου. Το ενδεχόμενο αυτό εξετάστηκε με καλλιέργειες φυσιολογικών CD4+ T λεμφοκυττάρων παρουσία ορού από υγιείς εθελοντές ή από ασθενείς με ενεργό ΣΕΛ. Η δράση του PD-1 μετά από ενεργοποίηση με την πρωτεΐνη PD-L1.Fc, εκτιμήθηκε μέσω του βαθμού αναστολής του Τ κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Σε συνθήκες μερικής ενεργοποίησης, διαπιστώθηκε μειωμένη ανασταλτική δράση του PD-1 παρουσία ορού από ασθενείς με ΣΕΛ σε σχέση με υγιείς εθελοντές (μείωση πολλαπλασιασμού κατά 6.7 ± 3.6% έναντι 16.3 ± 2.7%). Ωστόσο, ενεργοποίηση του PD-1 με αυξημένες συγκεντρώσεις PD-L1.Fc προκάλεσε σημαντικού βαθμού αναστολή του Τ κυτταρικού πολλαπλασιασμού ακόμα και παρουσία ορού από ΣΕΛ. Συμπερασματικά, τα ευρήματα της μελέτης αυτής υποστηρίζουν ένα σημαντικό ρόλο του ανασταλτικού συστήματος PD-1/PD-L1 στη ρύθμιση των Τ λεμφοκυττάρων στο ΣΕΛ. Τεκμηριώνεται διαταραχή της έκφρασης και λειτουργίας του PD-1 ως συνέπεια «άμεσων» (PD1.3 πολυμορφισμός, καλλιέργειες με αυτόλογα αποπτωτικά κύτταρα) και «έμμεσων» (φλεγμονώδες περιβάλλον) επιδράσεων στο λύκο. Η έκφραση του PD- 1/PD-L1 σε πειραματικά πρότυπα αυτοδραστικότητας και σε προσβεβλημένους ανθρώπινους ιστούς υποδεικνύουν συμμετοχή του ανοσορρυθμιστικού αυτού συστήματος στην Τ ανοσολογική ανοχή με δυνατότητα παρέμβασης για θεραπευτικούς σκοπούς.