Η επίδραση της μελατονίνης και άλλων αντιοξειδωτικών ουσιών στην ισχαιμική προετοιμασία του μυοκαρδίου

Abstract

Introduction: The overproduction of free radicals is responsible for causing damage to DNA, proteins and lipids, having an important role in the pathogenesis of coronary artery disease. Furthermore, free radicals are involved in the endogenous protective mechanism of ischemic preconditioning (IP). The aim of our study was to evaluate the way some well-known antioxidants induce or inhibit the beneficial effect of IP. Methods: The substances used were melatonin, vitamin E and vitamin C. We used male, New Zealand white rabbits, that were randomly divided into six (6) groups and subjected them to 30 minutes of myocardial ischemia followed by 180 minutes (3 hours) of reperfusion with the following prior interventions: a) control group - CTL: no additional interventions, b) vit.E and vit.C were administered at a dose of 150mg/kg body weight (b.w.) for 75 minutes or 50mg/kg b.w. (25mg/kg bolus and then 25mg/kg continuous infusion) as for melatonin, all of them starting 40 minutes before index ischemia and lasting through the 5th minute of reperfusion, c) vit.E and vit.C were given as previously described, but at a double dose of 300mg/kg b.w., d) ischemic preconditioning (PC): two cycles of IP ( two cycles of 5 minutes ischemia and 10 minutes reperfusion), e) combined, either vit.E or vit.C at a dose of 150mg/kg b.w. with IP, starting the infusion 10 minutes before the first IP cycle, and f) combined, either vit.E or vit.C at a dose of 300mg/kg b.w., as previously described in group e. Blood sample were taken for measuring SOD, MDA. By obtaining parts of both the ischemic and the non-ischemic heart areas, we checked for the presence of MDA, cGMP and conjugated dienes, as well as for the myocardial levels of vitamin E by high performance liquid chromatography. At the end of the experiment, the infarct-to-risk area ratio (I/R%) was calculated. Results: The administration of vitamin E both at a dose of 150 mg / kg b.w. and at 300 mg / kg b.w. without IP, significantly reduced the size of the infarction to 19.7 ± 2.8% and 18.8 ± 4.9%, respectively (P <0.01 compared to control group). In the lone IP group, the infarct size was significantly smaller 13.5 ± 3.3% (P <0.01 compared to control). However, the administration of vit.E in the same way as described above, even when combined with IP, did not significantly reduce the extent of infarction, when compared to the reduction offered by IP. The I/R% for groups E150-PC and E300-PC was 10.2 ± 3.1% and 12.4 ± 2.2%, respectively (P <0.01 vs. control). The 150 mg/kg b.w. and the 300 mg/kg b.w. Vitamin C groups did not significantly reduce the extent of infarction that was found 35.5 ± 4.1% and 38.3 ± 7.0%, respectively (P> 0.05 vs. control group). In the IP group, there was significantly less extended infacrt size, when compared to control group (15.7 ± 2.9%, P <0.01). The administration of vit.C together with IP had a negative effect in the reducing of the infarct size that was found in the IP team, by increasing its size, corresponding to 32.0 ± 2.7 % and 43.8 ± 3.3% for the group of vit.C150 and vit.C300 respectively (P <0.05 vs. IP). The administration of melatonin without IP did not reduce the extent of myocardial infarct in a significant way, being at 42.9 ± 3.6%. As expected, the IP group significantly reduced infarct size to 14 ± 1.7% (P <0.01 vs control and MEL-IR), though it did not further reduce it, when melatonin was added ( 13.6 ± 2.4% (P = NS vs. IP, but P <0.01 vs control and MEL-IR). Conclusions: Our experimental study showed that: a) melatonin does not abolish the protective effect of ischemic preconditioning, while being a powerful antioxidant, b) vitamin C inhibits the benefits of ischemic preconditioning, although confirming its strong antioxidant activity and finally, c) Vitamin E successfully preserves the protective effect of ischemic preconditioning, since it significantly reduced the infarct size without displaying a strong antioxidant profile. We also concluded that the mechanism of action of vitamin E was exerted through the activation of mitochondrial K+ - ATP channels, while its intravenous administration results in high concentrations of vitamin E in the myocardium that effectively protects against the dangerous phase of index persistent ischemia.

Εισαγωγή : Η υπερπαραγωγή ελεύθερων ριζών είναι υπεύθυνη για βλάβες στο DNA, στις πρωτεΐνες και στα λιπίδια και παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση της στεφανιαίας νόσου. Επιπλέον συμμετέχουν στον ενδογενή προστατευτικό μηχανισμό της ισχαιμικής προετοιμασίας (ΙΠ). Σκοπός της μελέτης μας ήταν να διαπιστώσουμε αν κάποιες αντιοξειδωτικές ουσίες επάγουν ή αναστέλλουν την ευεργετική δράση της ΙΠ. Μέθοδος : Οι ουσίες που χορηγήθηκαν ήταν η μελατονίνη, η βιταμίνη Ε και η βιταμίνη C. Χρησιμοποιήθηκαν αρσενικά λευκά κουνέλια Νέας Ζηλανδίας, τα οποία τυχαία σχημάτισαν έξι (6) ομάδες και υποβλήθηκαν σε 30 λεπτά τμηματικής μυοκαρδιακής ισχαιμίας, ακολουθούμενη από 180 λεπτά (3 ώρες) επαναιμάτωσης με τις ακόλουθες παρεμβάσεις : α) ομάδα ελέγχου – CTL : χωρίς επιπλέον παρεμβάσεις, β) ομάδα χορήγησης της ουσίας σε δόση 150mg/kg βάρους σώματος για συνολική διάρκεια 75 λεπτών, ξεκινώντας 40 λεπτά πριν την παρατεταμένη ισχαιμία έως και το 5ο λεπτό της επαναιμάτωσης, γ) ομάδα που η ουσία χορηγήθηκε με τον ίδιο τρόπο που περιγράφθηκε πριν, αλλά σε διπλάσια δόση, δηλαδή 300mg/kg βάρους σώματος, δ) ομάδα ισχαιμικής προετοιμασίας – ΙΠ(PC) : με δύο κύκλους ΙΠ, αποτελούμενοι ο καθένας από 5 λεπτά τμηματικής ισχαιμίας και 10 λεπτά επαναιμάτωσης, χωρίς να χορηγηθεί η ουσία, ε) ομάδα που η ουσία δόθηκε σε δόση 150mg/kg βάρους σώματος, με τον ίδιο τρόπο όπως προηγουμένως, αλλά εδώ τα κουνέλια υποβλήθηκαν επιπλέον και σε δύο (2) κύκλους ΙΠ, αρχίζοντας την έγχυση της ουσίας 10 λεπτά πριν τον 1ο κύκλο ΙΠ και στ) ομάδα που η ουσία δόθηκε σε δόση 300mg/kg βάρους σώματος, με τον ίδιο τρόπο όπως και στην ομάδα γ, αλλά εδώ τα κουνέλια υποβλήθηκαν επιπλέον και σε δύο (2) κύκλους ΙΠ με την έγχυση να ξεκινάει πάλι 10 λεπτά πριν τον 1ο κύκλο ΙΠ. Από το δείγμα αίματος που ελήφθη, έγινε μέτρηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας του οργανισμού (SOD - δισμουτάση του υπεροξειδίου) καθώς και της λιπιδικής υπεροξείδωσης (MDA - μηλονική διαλδεϋδη). Μετά από λήψη ιστοτεμαχίων από την ισχαιμική και από τη μη-ισχαιμική περιοχή της καρδιάς, ελέγχθηκε η παρουσία ορισμένων ενδοκυττάριων ουσιών (MDA, cGMP και συζευγμένα διένια), έγινε προσδιορισμός των μυοκαρδιακών επιπέδων της βιταμίνης Ε με υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφία και από την αφαιρεθείσα καρδιά προσδιορίσθηκε ο λόγος της εμφραγματικής προς την ισχαιμική περιοχή του μυοκαρδίου. Αποτελέσματα : Η χορήγηση της βιταμίνης Ε στη δόση των 150 mg/kg ΒΣ και 300 mg/kg BΣ, χωρίς την εφαρμογή της ισχαιμικής προετοιμασίας, ελλάτωσε την έκταση του εμφράγματος σε 19.7± 2.8% και 18.8±4.9% αντίστοιχα (P <0.01 συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου). Στην ομάδα που εφαρμόσθηκε η ισχαιμική προετοιμασία, το μέγεθος του εμφράγματος είχε σημαντικά μικρότερο μέγεθος 13.5 ± 3.3 % (P <0.01 συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου). Όμως, η χορήγηση της βιταμίνης Ε με τον ίδιο τρόπο όπως παραπάνω και σε συνδυασμό με την ισχαιμική προετοιμασία, δεν πρόσφερε σημαντική διαφορά στη μείωση της έκτασης του εμφράγματος συγκρινόμενα με τη μείωση που επέφερε η ισχαιμική προετοιμασία χωρίς τη χρήση της βιταμίνης Ε. Η τιμή του λόγου I/R% για τις ομάδες E150-PC και E300-PC ήταν 10.2 ± 3.1% και 12.4 ±2.2% αντίστοιχα (P < 0.01 vs. ομάδας ελέγχου). Στις ομάδες χορήγησης των 150 mg/kg και 300 mg/kg Β.Σ. της βιταμίνης C δεν ελαττώθηκε στατιστικώς σημαντικά η έκταση του εμφράγματος και βρέθηκε 35.5±4.1% και 38.3±7.0% αντίστοιχα (P > 0.05 vs. ομάδας ελέγχου). Στην ομάδα της ΙΠ παρατηρήθηκε σημαντικώς μικρότερη έκταση εμφράγματος σε σχέση με την ομάδα ελέγχου και συγκεκριμένα 15.7±2.9% (P < 0.01). Η χορήγηση όμως της βιταμίνης C μαζί με την εφαρμογή ΙΠ επέδρασε στη μείωση του εμφράγματος που παρουσίασε από μόνη της η ομάδα της ΙΠ, αυξάνοντας την έκτασή του και αντίστοιχα για την ομάδα βιτ.C150-ΙΠ και βιτ.C300-ΙΠ σε 32.0±2.7% και 43.8±3.3% (P < 0.05 vs. ΙΠ). Η χορήγηση της μελατονίνης χωρίς ΙΠ δεν μείωσε την έκταση του εμφράγματος στατιστικώς σημαντικά και συγκεκριμένα ήταν 42.9±3.6%. Ως αναμενόμενο, στην ομάδα που εφαρμόσθηκε ΙΠ παρατηρήθηκε σημαντική ελάττωση της εμφραγματικής περιοχής 14±1.7% (P < 0.01 vs ομάδας ελέγχου και ομάδας MEL-IR), αλλά δεν είχαμε περαιτέρω μείωση της εμφραγματικής περιοχής με την προσθήκη μελατονίνης, παρουσιάζοντας μέγεθος εμφράγματος 13.6±2.4%(P=NS vs. PC, αλλά P < 0.01 vs ομάδας ελέγχου και ομάδας MEL-IR). Συμπεράσματα : Τα βασικά συμπεράσματα που προέκυψαν από την παρούσα πειραματική μελέτη μας είναι : α) η μελατονίνη δεν αναιρεί την προστατευτική δράση της ισχαιμικής προετοιμασίας στο μυοκάρδιο και παράλληλα ασκεί ισχυρή αντιοξειδωτική δράση, β) η βιταμίνη C ανέστειλε την προστατευτική δράση της ισχαιμικής προετοιμασίας στο μυοκάρδιο, ασκώντας ταυτόχρονα ισχυρότατη αντιοξειδωτική δράση και γ) η βιταμίνη Ε ευόδωσε συνεργικά την προστατευτική δράση της ισχαιμικής προετοιμασίας στο μυοκάρδιο, μειώνοντας σημαντικότατα την έκταση της εμφραγματικής περιοχής, χωρίς να εμφανίσει παράλληλα ισχυρή αντιοξειδωτική δράση. Διαπιστώσαμε πως ο μηχανισμός δράσης της βιταμίνης Ε ασκείται μέσω της ενεργοποίησης των μιτοχονδριακών K+-ATP καναλιών, ενώ η ενδοφλέβια χορήγησή της έχει ως αποτέλεσμα μεγάλες συγκεντρώσεις της βιταμίνης Ε στο μυοκάρδιο, το οποίο και προστατεύουν αποτελεσματικά κατά τη φάση της επικίνδυνης, εμμένουσας ισχαιμίας.