Μελέτη γονιδίων που εμπλέκονται σε μηχανισμούς νευροεκφύλισης στο γενετικό μοντέλο ντοπαμινεργικής απονεύρωσης μυός weaver και σε λεμφοκύτ...

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease of the CNS, affecting 1%-2% of the aging population. The main histopathology of the disease is characterized by the progressive degeneration of the dopaminergic neurons of the substantia nigra leading to primary symptoms that are correlated to motor abnormalities. The diagnosis of PD is possible only after its primary symptoms appear, when a severe degree of neurodegeneration has already occurred. Moreover, the symptoms are not specific for the disease, weakening the accuracy of its diagnosis, especially in its early stages. The etiology of the disease remains unknown. PD is considered to be a rather multifactorial syndrome, the pathogenic mechanisms of which have not yet been clarified, as the onset of the disease cannot be identified presymptomatically. The present thesis had two primary targets: 1) The study of the pathogenesis of the degeneration of the nigrostriatal pathway and 2) the detection of the pathological phenotype of PD in blood. 1) Towards the first direction, the mutant mouse weaver was studied, which represents a unique genetic model of progressive nigrostriatal neurodegeneration. Its pathophysiological phenotype lies on an autosomal missense mutation identified in the girk2 gene, which codes for a subunit of a G-protein-activated inwardly rectifying K+ channel. Although this mutation was not correlated to PD in humans, similar subpopulations of dopaminergic neurons are affected and characterize the pathology of both PD and the weaver mouse model. In addition, a crucial advantage in weaver mice is that the onset of the progressive dopaminergic degeneration is known and thus, can be studied. Based on these facts, the first aim of this thesis was the identification of candidate genes involved in the initiation of the dopaminergic degeneration in weaver mice. In this context, the complete transcriptional profile of the affected midbrain area of weaver mice was investigated using mouse full-genome DNA microarrays. Seven days-old mice were selected for this study, a time point that is currently the last reported at which no neurodegeneration has yet occured in the weaver midbrain. The results that were obtained include a relatively small number of genes that exhibit a limited but significant change in their expression levels. These genes are separated based on their function in four categories that concern the physiology of the synapse or neurotransmission, signal transduction, the regulation of transcription and transport. In the current experimental approach, the broader midbrain area of weaver mice was examined that besides the substantia nigra it includes other non affected dopaminergic or non dopaminergic areas, thus inducing quite a dilution to the genes identified to alter their expression significantly during the initiation of dopaminergic degeneration in weaver mice. However, the gene functions detected to be affected in this study have also been reported in PD and in the MPTP neurotoxical mouse model, even in the early stages of neurodegeneration. Notably, this is the first time such a study of the molecular pathogenic mechanisms of dopaminergic death is conducted so early in the neurodegenerative process, even before cell death begins to be observed. Among the genes whose transcriptional profile was found to specifically characterize the midbrain area of weaver mice, certain genes were selected to be validated by QPCR in a new group of weaver mice, based on their function and their ratio of differential gene expression in the mutant mice. The genes validated to alter their expression profile in the midbrain of weaver mice include supt16h, lasp1, dlgh4 and a predicted transcript variant of nurr1. Supt16h codes for the large subunit of the FACT complex, a chromatin remodeling complex playing an important role in transcription processing. The down regulation of Supt16h in the midbrain of weaver mice could imply a more generalized reduction of the transcriptional activity in the area. Nurr1 is an early gene playing an established role in the development and maintenance of dopaminergic neurons, whereas several mutations of the gene have been associated with PD. Changes in the expression level of Nurr1 might be observed either because of a compensative mechanism taking place in the early stages of dopaminergic degeneration, or alternatively due to the involvement of Nurr1 in the pathogenesis of the nigrostriatal neurodegeneration. Lasp1 and Dlgh4 were found to be downregulated in the midbrain of weaver mice. They code for two synaptic proteins that play a very important role in neurotransmission and post-synaptic response. The decrease of the expression levels of both genes in weaver mice could lead to signaling impairment in the synapse or to abnormalities in the post-synaptic response to stimuli affecting synaptic physiology. Furthermore, the down-regulation of those two synaptic proteins could induce alterations in the architecture of the synapse that would be expected to affect the pre-synaptic neuron as well. In summary, both transcriptional activity change and synaptic function loss or impairment as they are detected through the identification of genes that specifically differentiate their transcriptional profile in the midbrain of weaver mice are potentially processes that are observed to take place in the midbrain before the initiation of the dopaminergic degeneration. Further histological analysis of the expression pattern of those genes in the midbrain of weaver mice could possibly indicate a new molecular direction towards understanding the triggering of dopaminergic cell death. 2) The second goal of the current thesis was the detection of the molecular fingerprint of PD in a peripheral tissue. In this direction, the peripheral blood lymphocytes (PBLs) were chosen to be used. PBLs are an easily accessible tissue, expressing several neurotransmitter receptors that are believed to reflect the function of their brain homologues. Especially in relation to PD, PBLs have been found to normally express dopamine receptors that are upregulated in the disease, while both their dopamine content and the immunoreactivity of tyrosine hydroxylase are reduced in the early stages of PD. Those findings enhance the consideration of PBLs as a putative peripheral marker of CNS impairment in PD. To investigate the transcriptional profile of the lymphocytes from PD patients, a high-throughput analysis of gene expression was carried out using whole–genome human DNA microarrays. The PD patients that were used for this survey were all recently diagnosed to suffer from the disease and had received no treatment. The comparison of the transcriptome in lymphocytes between PD patients and age- and sex-matched healthy subjects identified that PD patients, in terms of their transcriptional profile in PBLs , are categorized separately from the healthy subjects, without however differing dramatically. Moreover, the analysis of gene expression among all samples pointed that age, at least its large variations, affects the transcriptional profile of lymphocytes more actively than sex or the disease itself. The clustering of samples according to their gene expression grouped all healthy subjects of advanced age together, regardless of their sex. On the contrary, the group of PD patients is more heterogeneous, a fact indicating that there might be other disease factors that regulate the transcriptional profile of lymphocytes besides the general clinical phenotype of the disease. Taking into consideration the variability of PD patients, as well as the effect of age on the results obtained, besides the main general comparison between all PD patients and all healthy subjects, another comparison was tried between only those PD patients and healthy subjects that are grouped separately between them based on the clustering outcome. The genes identified to specifically change their expression levels in the lymphocytes of PD patients have functions regarding protein biosynthesis transcription, transport, signal transduction and metabolism. Those functions either reflect the mechanisms underlying the pathology of SN in PD, or represent a peripheral response to the disease, the pathology of which extends beyond the brain to the periphery. The correlation of some of the genes identified in this study to previous studies of PD or brain physiology offers a biological background towards understanding the putative molecular fingerprint of PD in lymphocytes.

Η νόσος του Πάρκινσον (ΝΠ) είναι η δεύτερη πιο συχνά εμφανιζόμενη νευροεκφυλιστική νόσος του ΚΝΣ και επηρεάζει το 1%-2% του γηράσκοντα πληθυσμού. Η κύρια ιστοπαθολογία της νόσου χαρακτηρίζεται από την προοδευτική εκφύλιση των ντοπαμινεργικών κυττάρων της μέλαινας ουσίας, γεγονός που οδηγεί στην εμφάνιση των πρωτογενών συμπτωμάτων της νόσου τα οποία σχετίζονται με κινητικές δυσλειτουργίες. Τα συμπτώματα της νόσου, στα οποία στηρίζεται η διάγνωσή της, εμφανίζονται αφού ένας σημαντικός αριθμός ντοπαμινεργικών νευρώνων έχει ήδη εκφυλιστεί. Επιπρόσθετα, τα συμπτώματα αυτά δεν είναι ειδικά για τη ΝΠ, θέτοντας τη διάγνωσή της ειδικά στα πρώτα στάδια εκδήλωσής της σχετικά επισφαλή. Η αιτιολογία της νόσου παραμένει άγνωστη έως σήμερα. Η ΝΠ θεωρείται ένα πολυπαραγοντικό σύνδρομο, οι μηχανισμοί παθογένειας της οποίας είναι ακόμα αδιευκρίνιστοι, καθώς τα πρώτα στάδια εξέλιξής της, στα οποία η όποια θεραπεία αναμένεται να είναι πιο αποτελεσματική, δε γίνονται αντιληπτά και κατά συνέπεια δεν μπορούν να μελετηθούν άμεσα στον άνθρωπο. Η παρούσα ερευνητική εργασία είχε 2 σκοπούς: 1) τη μελέτη της παθογένειας της εκφύλισης της μελαινοραβδωτής οδού και 2) την ανίχνευση του παθολογικού φαινοτύπου της ΝΠ σε περιφερειακό ιστό. 1) Στα πλαίσια της πρώτης κατεύθυνσης μελετήθηκε ο μεταλλαγμένος μυς weaver, που αντιπροσωπεύει ένα μοναδικό γενετικό μοντέλο προοδευτικής εκφύλισης της μελαινοραβδωτής οδού. Ο ιστοπαθολογικός του φαινότυπος στηρίζεται σε μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο girk2 που κωδικοποιεί μια υπομονάδα των GIRK καναλιών. Αν και η μετάλλαξη αυτή βρέθηκε να μη συσχετίζεται με την εμφάνιση της ΝΠ στον άνθρωπο, ανάλογοι υποπληθυσμοί ντοπαμινεργικών κυττάρων εκφυλίζονται και χαρακτηρίζουν την παθολογία του μοντέλου όσο και της νόσου. Σημαντικό πλεονέκτημα του μοντέλου weaver επίσης είναι ότι η έναρξη της νευροεκφυλιστικής διαδικασίας είναι γνωστή και άρα μπορεί να μελετηθεί. Έχοντας ως βάση τα προηγούμενα, κύριος στόχος της ερευνητικής αυτής προσέγγισης ήταν ο προσδιορισμός υποψήφιων γονιδίων που ενέχονται στην έναρξη της ντοπαμινεργικής εκφύλισης στο μοντέλο weaver. Για το σκοπό αυτό εξετάστηκε το μεταγραφικό προφίλ ολόκληρου του γονιδιώματος της ευρύτερης θιγόμενης περιοχής του μεσεγκεφάλου weaver και φυσιολογικών μυών χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες DNA πλήρους γονιδιώματος μυός. Επιλέχτηκαν μύες 7 ημερών, ηλικίας που βρίσκεται ακριβώς πριν την έναρξη της εκφυλιστικής διαδικασίας. Τα αποτελέσματα που παρήχθησαν περιλαμβάνουν ένα σχετικά μικρό αριθμό γονιδίων που σημειώνουν περιορισμένη αλλά σημαντική αλλαγή των επιπέδων έκφρασης τους στους weaver μύες. Τα γονίδια αυτά διακρίνονται με βάση την λειτουργία τους σε 4 κατηγορίες που αφορούν στη φυσιολογία της σύναψης ή τη νευροδιαβίβαση, τη μεταγωγή σήματος, την ενεργοποίηση της μεταγραφής και τη μεταφορά. Αν και εξετάστηκε η ευρύτερη περιοχή του μεσεγκεφάλου που παράλληλα με τη μέλαινα ουσία περιλαμβάνει και μη θιγόμενες ντοπαμινεργικές ή μη περιοχές και επιφέρει σημαντική αραίωση στα αποτελέσματα των γονιδίων που εμπλέκονται στην εκφύλιση της μελαινοραβδωτής οδού, οι λειτουργίες αυτές έχουν βρεθεί ότι επηρεάζονται στη ΝΠ και στο νευροτοξικό μοντέλο MPTP σε μύες, ακόμα και σε πρώιμα στάδια νευροεκφύλισης. Μάλιστα, είναι η πρώτη φορά που μία τέτοια προσπάθεια προσδιορισμού των μοριακών μηχανισμών παθογένειας του ντοπαμινεργικού θανάτου πραγματοποιείται σε τόσο πρώιμο στάδιο, πριν ουσιαστικά η εκφύλιση αρχίσει να παρατηρείται. Μεταξύ των γονιδίων των οποίων το μεταγραφικό προφίλ βρέθηκε να χαρακτηρίζει ειδικά τη μεσεγκεφαλική περιοχή των μυών weaver, επιλεχτήκαν να πιστοποιηθούν περαιτέρω με QPCR σε μια νέα ομάδα ζώων της ίδιας ηλικίας συγκεκριμένα γονίδια με γνώμονα τη λειτουργία τους και το ποσοστό της αλλαγής των επιπέδων έκφρασής τους στα μεταλλαγμένα ζώα. Τα γονίδια που πιστοποιήθηκαν ότι αλλάζουν το προφίλ της έκφρασής τους στο μεσεγκέφαλο των weaver μυών περιλαμβάνουν το supt16h, το lasp1, το dlgh4 και ένα καινούργιο μετάγραφο του nurr1. Το supt16h κωδικοποιεί τη μεγάλη υπομονάδα του συμπλόκου FACT, το οποίο είναι σύμπλοκο αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης και παίζει σημαντικό ρόλο στη διεκπεραίωση της μεταγραφικής διαδικασίας. Η μείωση της έκφρασης του supt16h στο μεσεγκέγαλο των μυών weaver είναι πιθανό να σηματοδοτεί ένα γενικότερο μηχανισμό μείωσης της μεταγραφικής δραστηριότητας στην περιοχή. Το nurr1 είναι ένα πρώιμο γονίδιο με καλά χαρακτηρισμένη λειτουργία στην ανάπτυξη και διατήρηση των ντοπαμινεργικών νευρώνων, ενώ μεταλλάξεις του έχουν εμπλακεί στην παθογένεια της ΝΠ. Αλλαγές στο προφίλ έκφρασης του ίσως σηματοδοτούν ένα αντισταθμιστικό μηχανισμό που ενεργοποιείται στη θιγόμενη περιοχή στα πρώιμα στάδια εκφύλισης ή εμπλέκονται στους μοριακούς μηχανισμούς παθογένειας της νευροεκφύλισης. Το lasp1 και το dlgh4 παρατηρήθηκαν να μειώνουν τα επίπεδα της έκφρασής τους στο μοντέλο weaver. Πρόκειται για 2 γονίδια που κωδικοποιούν 2 συναπτικές πρωτεΐνες με πολύ σημαντικό ρόλο στη νευροδιαβίβαση και την απόκριση του μετασυναπτικού νευρώνα. Η μείωση των επιπέδων των πρωτεϊνών αυτών στο μοντέλο weaver μπορεί να οδηγήσει σε δυσλειτουργία της σηματοδότησης στη σύναψη ή της απόκρισης του μετασυναπτικού κυττάρου σε μηχανισμούς που τροποποιούν τη συναπτική φυσιολογία. Επιπρόσθετα, η μείωση των επιπέδων των συναπτικών αυτών πρωτεϊνών θα μπορούσε να επιφέρει αλλαγές στην αρχιτεκτονική της σύναψης, οι οποίες είναι αναμενόμενο να έχουν αντίκτυπο και στο προσυναπτικό άκρο. Συνοψίζοντας, τόσο η μεταβολή της μεταγραφικής δραστηριότητας όσο και η απώλεια ή η διαταραχή της συναπτικής λειτουργίας όπως ανιχνεύονται από τον προσδιορισμό των γονιδίων που διαφοροποιούν το μεταφραφικό τους προφίλ ειδικά στο μεσεγκέφαλο των weaver μυών, υπαινίσσονται διαδικασίες που ενεργοποιούνται στην ευρύτερη περιοχή πριν η εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων αρχίσει να παρατηρείται. Η περαιτέρω ιστολογική ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων αυτών στο μεσεγκέφαλο των weaver μυών, ίσως σηματοδοτεί μια νέα μοριακή κατεύθυνση στη διερεύνηση της έναρξης της εκφυλιστικής διαδικασίας στα ντοπαμινεργικά κύτταρα. 2) Ο δεύτερος σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η προσπάθεια ανίχνευσης του μοριακού αποτυπώματος της ΝΠ σε περιφερειακό ιστό. Προς την κατεύθυνση αυτή χρησιμοποιήθηκαν περιφερειακά λεμφοκύτταρα αίματος επειδή είναι ένας εύκολα προσβάσιμος ιστός, στον οποίο η έκφραση υποδοχέων νευροδιαβιβαστών έχει προταθεί ότι μπορεί να αντικατοπτρίζει την κατάσταση των ομόλογων υποδοχέων του εγκεφάλου, ενώ ειδικά σε σχέση με τη ΝΠ, έχει δειχθεί ότι εκφράζουν φυσιολογικά υποδοχείς ντοπαμίνης οι οποίοι υπερεκφράζονται στη νόσο, ενώ το περιεχόμενο της ντοπαμίνης και η ανοσοαπόκριση της υδροξυλάσης της τυροσίνης μειώνονται στα πρώιμα στάδια της νόσου. Τα στοιχεία αυτά ενισχύουν το ρόλο των λεμφοκυττάρων ως περιφερικό δείκτη της δυσλειτουργίας του ΚΝΣ στη ΝΠ. Για τη μελέτη του μεταγραφικού προφίλ των λεμφοκυττάρων ασθενών της ΝΠ χρησιμοποιήθηκαν πρωτοδιαγνωσμένοι ασθενείς που δεν είχαν λάβει καμία θεραπεία. Πραγματοποιήθηκε υψηλής κλίμακας ανάλυση της γονιδιακής τους έκφρασης με μικροσυστοιχίες DNA πλήρους γονιδιώματος ανθρώπου. Από τη σύγκριση των παρκινσονικών ασθενών με φυσιολογικά άτομα ιδίου φύλου και κατά το δυνατόν αντίστοιχης ηλικίας, η κατηγοριοποίηση όλων των δειγμάτων της έρευνας με βάση το μεταγραφικό προφίλ όλων των γονιδίων τους έδειξε ότι τα παρκινσονικά άτομα διαχωρίζονται μεν, δε διαφέρουν όμως πάρα πολύ από τα φυσιολογικά. Επιπρόσθετα, από την ανάλυση των αποτελεσμάτων της γονιδιακής έκφρασης σε όλα τα δείγματα προέκυψε ότι η ηλικία, τουλάχιστον οι μεγάλες διακυμάνσεις της, παίζει πιο δραστικό ρόλο στον καθορισμό του μεταγραφικού προφίλ των λεμφοκυττάρων από ότι η νόσος ή το φύλο. Η ομαδοποίηση των δειγμάτων με βάση το πρότυπο της γονιδιακής τους έκφρασης έδειξε ότι τα φυσιολογικά άτομα κατηγοριοποιούνται μαζί σε μία ομάδα παρότι είναι διαφορετικού φύλου. Αντίθετα, το σύνολο των παρκινσονικών ασθενών που χρησιμοποιήθηκαν είναι πιο ετερογενές, γεγονός που υποδεικνύει ότι πέρα από τον κλινικό φαινότυπο των ασθενών και το στάδιο της νόσου, υπάρχουν άλλοι παράγοντες της νόσου που ρυθμίζουν το μεταγραφικό προφίλ των λεμφοκυττάρων . Λαμβάνοντας υπόψη αυτήν την ποικιλομορφία των παρκινσονικών ασθενών καθώς και το ρόλο της ηλικίας στην εξαγωγή των αποτελεσμάτων, παράλληλα με την κύρια σύγκριση μεταξύ όλων των φυσιολογικών και όλων των παρκινσονικών ατόμων, δοκιμάστηκε μία ακόμη σύγκριση μεταξύ μόνο των παρκινσονικών και υγιών εκείνων ατόμων που πέρα από το χαρακτηρισμό τους διαχωρίζονται μεταξύ τους και από το προφίλ της γονιδιακής τους έκφρασης με βάση τα αποτελέσματα της κατηγοριοποίησης. Τα γονίδια που προέκυψαν από τις συγκρίσεις αυτές να μεταβάλλουν τα επίπεδα έκφρασης τους στα λεμφοκύτταρα των παρκινσονικών ασθενών αφορούν σε λειτουργίες που αντιστοιχούν στη βιοσύνθεση των πρωτεϊνών και τη μεταγραφή, τη μεταφορά, τη μεταγωγή σήματος και το μεταβολισμό. Οι λειτουργίες αυτές είτε αφορούν σε μηχανισμούς που έχουν βρεθεί να διαταράσσονται στη μέλαινα ουσία της ΝΠ, ή αντιπροσωπεύουν μια περιφερική απόκριση στη νόσο, η παθολογία της οποίας επεκτείνεται έξω από τον εγκέφαλο. Ο προσδιορισμός συγκεκριμένων γονιδίων μεταξύ των αποτελεσμάτων που έχουν ήδη εμπλακεί στη ΝΠ ή παίζουν ρόλο στη φυσιολογία του εγκεφάλου, προσφέρει ένα βιολογικό υπόβαθρο στην προσπάθεια διερεύνησης του μοριακού αποτυπώματος της ΝΠ στα λεμφοκύτταρα.