Μοριακός χαρακτηρισμός του φαινοτύπου μεθυλίωσης των νησίδων CpG (CIMP) στο σποραδικό καρκίνο του παχέος εντέρου

Abstract

DNA methylation is important for normal development and cancer pathology. Current notion postulates that DNA methylation of regulatory sequences contributes to carcinogenesis by conferring transcriptional silencing of tumor suppressor genes. Both methylation and demethylation is employed to build up the patterns of genomic methylation that characterize each cell type as a molecular fingerprint. Demethylation is occurring in regulatory sequences while DNA methylation is enriched in regulatory, coding and repeat regions alike. Dnmts the enzymes building up the genomic methylation patterns have being recognized as dual specificity enzymes, acting either as DNA methyltransferases which methylate cytosines in the context of CpG dinucleotides or as deaminases by converting methylated cytosines to thymines. These thymines are recognized in DNA mismatches and are replaced by cytosines via DNA repair pathways. Cancer cells as opposed to normal cells, present abnormal DNA methylation, summarized into hypermethylation of transcription regulatory elements and hypomethylation of the rest of the genome. This situation is best characterized in sporadic colorectal cancers and is called CpG Island Methylator Phenotype (CIMP). CIMP Iis correlated with a common BRAF mutation namely, BRAFV600E. Although, the molecular mechanism of CIMP is currently unknown, a deregulation of Dnmts is implied. Our research reveals that under physiologic conditions Dnmt3a1 exhibits dual enzymatic specificity in mESCs and that its deregulation affects gene expression during mESC differentiation via retinoic acid treatment. More specifically, Dnmt3a1 is responsible for the permanent silencing of pluripotency genes -that are additionally found into chromosomal clusters- and for the efficient expression of a distinct set of genes which are important for organism’s growth and welfare. Moreover, Dnmt3a1 plays a crucial role in maintaining the Imprint DNA methylation in mESCs. Additionally, we find that Dnmt3a1 and the DNA methylation machinery is differentially targeted by wt and mutant BRAFV600E proteins. In light of our findings, we propose that CIMP pathology is directly related to the deregulation of the equilibrium between DNA methylation and cytidine deamination. To resolve this, an experimental system based on mouse colon adult stem cells and samples from CIMP cancer human biopsies is needed. This hypothesis was not further investigated in the present work, due to lack of biological samples.

Η μεθυλίωση του DNA είναι σημαντική για τη φυσιολογική ανάπτυξη αλλά και για την καρκινική παθολογία. Η σύγχρονη άποψη πρεσβεύει ότι η γενωμική μεθυλίωση ρυθμιστικών αλληλουχιών ευθύνεται για την καρκινογένεση επειδή προκαλεί την μεταγραφική αποσιώπηση των ογκο-κατασταλτικών γονιδίων. Η μεθυλίωση και η απομεθυλίωση του γονιδιώματος δημιουργούν τα πρότυπα μεθυλίωσης που χαρακτηρίζουν τους κυτταρικούς τύπους σαν μοριακό αποτύπωμα. Η απομεθυλίωση λαμβάνει χώρα στις ρυθμιστικές περιοχές των γονιδίων ενώ πλούσιες σε μεθυλίωση περιοχές είναι είτε οι ρυθμιστικές είτε οι κωδικές ή οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες του γονιδιώματος. Οι μεθυλοτρανσφεράσες DNA, τα ένζυμα που δημιουργούν τα πρότυπα γενωμικής μεθυλίωσης έχουν χαρακτηριστεί ως διπλής ειδικότητας ένζυμα, τα οποία δρούν είτε ως DNA μεθυλοτρανφεράσες που μεθυλιώνουν κυτοσίνες στα πλαίσια δινουκλεοτιδίων CpG ή ως απαμινάσες που μετατρέπουν τις μεθυλιωμένες κυτοσίνες σε θυμίνες. Αυτές οι θυμίνες αναγνωρίζονται από τον κυτταρικό «Ορθογραφικό μηχανισμό» και αντικαθίστανται από κυτοσίνες μέσω από μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA. Τα καρκινικά κύτταρα σε αντίθεση με τα φυσιολογικά, παρουσιάζουν μη-φυσιολογικά πρότυπα μεθυλίωσης τα οποία συνοψίζουν τα εξής χαρακτηριστικά: α) υπερμεθυλίωση των ρυθμιστικών μεταγραφικών στοιχείων β) υπομεθυλίωση του υπόλοιπου γονιδιώματος. Αυτή η κατάσταση έχει χαρακτηρισθεί στο σποραδικό καρκίνο του παχέος εντέρου και ονομάζεται «Φαινότυπος μεθυλίωσης των νησίδων CpG» ή αλλιώς CIMP. Ο τύπος καρκίνου CIMP σχετίζεται με μία συχνή μετάλλαξη της κινάσης σερινών-θρεονινών BRAF και συγκεκριμένα την BRAFV600E. Παρόλο που ο μοριακός μηχανισμός του CIMP είναι προς το παρόν άγνωστος μπορεί εντούτοις να υποτεθεί ότι οφείλεται στην απορύθμιση των Dnmts. Η ερευνά μας αποκαλύπτει ότι υπό φυσιολογικές συνθήκες η Dnmt3a1 εμφανίζει διπλή εζυματική δράση στα ΕΒΚ του ποντικού και η απορύθμισή της επηρρεάζει τη γονιδιακή έκφραση κατά τη εξαρτώμενη από ρετινοϊκό οξύ διαφοροποίηση αυτών των κυττάρων. Ειδικότερα η Dnmt3a1 είναι υπεύθυνη για τη μόνιμη αποσιώπηση γονιδίων πολυδυναμικότητας –τα οποία επιπλέον είναι και συνδεδεμένα- και για την αποτελεσματική έκφραση συγκεκριμένου υποσυνόλου γονιδίων τα οποία είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη και την ευρωστία του οργανισμού. Η Dnmt3a1 παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση του γενωμικού εντυπώματος σε αυτά τα κύτταρα. Επιπλέον, βρίσκουμε ότι η Dnmt3a1 και η μοριακή μηχανή μεθυλίωσης του DNA αποτελούν διαφορικούς στόχους της αγρίου τύπου BRAF και μεταλλαγμένης κινάσης BRAFV600E. Βασιζόμενοι στα ευρήματά μας προτείνουμε ότι η καρκινική παθολογία στις περιπτώσεις CIMP σχετίζεται άμεσα με την απορύθμιση του ισοζυγίου γενωμικής μεθυλίωσης και ενεργής απομεθυλίωσης. Για να αποδειχθεί αυτό χρειάζεται ένα πειραματικό σύστημα το οποίο θα περιλαμβάνει ενήλικα βλαστικά κύτταρα του εντερικού επιθηλίου του ποντικού και δείγματα βιοψιών από ανθρώπινους καρκίνους. Η υπόθεσή μας αυτή δεν μελετήθηκε περαιτέρω στην παρούσα εργασία λόγω έλλειψης βιολογικού υλικού.