Μοριακή σταδιοποίηση στον καρκίνο του παχέος εντέρου

Abstract

Colorectal cancer (CRC) is one of the most frequently diagnosed malignancies in both men and women. Although curative resection is the major treatment option, approximately half of all patients eventually develop distant metastases. Overall survival is associated with the disease stage at the time of diagnosis, suggesting that early detection of disseminated disease may be of great significance. Detection of disseminated tumor cells in the peripheral blood of CRC patients could be promising towards prompt diagnosis of disseminated disease and monitoring of CRC patients. Various techniques have been used for the detection of circulating tumor cells (CTCs) derived by solid tumors; among those, RT-PCR-based methods have allowed the sensitive detection of CTCs in peripheral blood samples. Amongst several molecular markers, carcinoembryonic antigen (CEA), cytokeratin 20 (CK20) and epidermal growth factor receptor (EGFR) are those more frequently used for CTC detection in colorectal cancer using PCR-based methods. Several studies have shown that the use of more than one marker independently increases both the sensitivity and the specificity of CTC detection in CRC patients. However, the application of separate PCR reactions for each marker can be impractical, while the implementation of multiplex RT-PCR allows the examination of multiple marker expression in a single reaction. The employment of multiplex RT-PCR in peripheral blood samples represents an easily applied, non-invasive technique for the detection of CTCs in CRC patients. The present study aimed at the development of a multiplex RT-PCR assay capable of assessing the presence of CEA, CK20 and EGFR transcripts in the peripheral blood of CRC patients and subsequently at the evaluation of this assay’s clinical significance. The initial development was performed using the CRC cell line HT-29, as well as tissue specimens taken from CRC patients during surgery. Once the conditions were normalized, the multiplex RT-PCR was implemented on peripheral blood samples collected from 88 CRC patients and 40 healthy individuals. The positive detection rates of CEA, CK20 and EGFR transcripts were analyzed in relation to patient clinical and pathological characteristics, as well as overall survival. Median follow-up period was 19 months (range 8-28 months). The rates of CEA, CK20 and EGFR detections in CRC patients were significantly higher compared to those in healthy volunteers. Among the patient samples, 95.5% were tested positive for at least one marker, whereas 7.5% of healthy donor samples were found to express CEA mRNA; all control samples were tested negative for CK20 and EGFR transcripts. The increasing number of positive detections for CEA, CK20 and EGFR transcripts in each blood sample was positively correlated with Astler-Coller disease stage and preoperative serum levels of CEA in CRC patients. Survival analysis documented significant differences in the overall survival of the different CRC patient groups as formed according to the increasing number of positivity for CEA, CK20 and EGFR transcripts. These data suggest that the multiplex RT-PCR assay, as developed herein, can provide useful information concerning disease stage and overall survival of CRC patients and could serve as a reliable clinical tool for the early detection of disseminated disease and CRC patient screening in the future

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου (ΚΠΕ) αποτελεί μία από τις πλέον συχνές μορφές καρκίνου, αναφορικά τόσο με τη συχνότητα εμφάνισης όσο και με τη θνησιμότητα. Για την ώρα, κύρια θεραπευτική στρατηγική αποτελεί η χειρουργική αφαίρεση του όγκου, ακολουθούμενη από χημειοθεραπεία. Ωστόσο, ακόμη και μετά από ολική αφαίρεση του όγκου περίπου οι μισοί ασθενείς τελικά χάνουν τη ζωή τους εξαιτίας της εμφάνισης απομακρυσμένων μεταστάσεων. Η πιθανότητα επιβίωσης ενός ασθενούς που διαγιγνώσκεται με ΚΠΕ βρίσκεται σε άμεση συσχέτιση με το στάδιο του καρκίνου, ένα γεγονός που τονίζει την αναγκαιότητα έγκαιρης ανίχνευσης της διασποράς της νόσου. Η αλματώδης πρόοδος στις μεθόδους της μοριακής βιολογίας προσδίδει σημαντικό πλεονέκτημα προς τη βελτίωση της ακρίβειας ανίχνευσης και την κατανόηση της βιολογίας των καρκινικών κυττάρων της κυκλοφορίας, με απώτερο στόχο την ταυτοποίηση εκείνων των κυτταρικών κλασμάτων που εμφανίζουν μεταστατικό δυναμικό και συνεπώς τη μεγαλύτερη προγνωστική σημαντικότητα. Για όλους τους πιο πάνω λόγους γίνεται ξεκάθαρο πως ένα σύστημα σταδιοποίησης που βασίζεται σε μοριακές παραμέτρους εμφανίζει σημαντικές δυνατότητες. Η χρήση καρκινικών δεικτών μπορεί να αποδειχθεί πολύτιμη στην πρόγνωση της νόσου, καθώς και στην εξατομικευμένη παρακολούθηση της ανταπόκρισης των ασθενών στη θεραπεία. Ανάμεσα στο μεγάλο αριθμό των μεθοδολογικών προσεγγίσεων για την ανίχνευση κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων που προέρχονται από συμπαγείς όγκους, η τεχνική PCR έχει προσφέρει τη δυνατότητα ανίχνευσης καρκινικών κυττάρων σε δείγματα 138 περιφερικού αίματος με μεγάλη αποτελεσματικότητα. Από τους συχνότερα χρησιμοποιούμενους καρκινικούς δείκτες για τον ΚΠΕ ξεχωρίζουν τα mRNA του καρκινοεμβρυϊκού αντιγόνου (CEA), της κυτοκερατίνης 20 (CK20) και του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), ενώ αρκετές πρόσφατες έρευνες δείχνουν πως η χρήση καθενός από τους δείκτες αυτούς σε ανεξάρτητη βάση αυξάνει τόσο την ειδικότητα όσο και την ευαισθησία ανίχνευσης κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων σε ασθενείς με ΚΠΕ. Εντούτοις, η εφαρμογή ενός αριθμού αντιδράσεων PCR για καθέναν από τους χρησιμοποιούμενους δείκτες εμφανίζει οικονομικό κόστος και απαιτεί από τον ερευνητή την ενασχόληση με κάθε εξεταζόμενο δείγμα για μεγάλο χρονικό διάστημα. Από την άλλη πλευρά, η εφαρμογή multiplex RT-PCR σε δείγματα περιφερικού αίματος ασθενών με ΚΠΕ επιτρέπει την εξέταση της έκφρασης πολλών δεικτών σε μία απλή αντίδραση και αντιπροσωπεύει μία εύκολα εφαρμόσιμη και μη διεισδυτική μέθοδο ανίχνευσης κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν αρχικά η ανάπτυξη μιας μεθόδου multiplex RT-PCR η οποία να προσφέρει τη δυνατότητα αξιόπιστης ανίχνευσης των δεικτών CEA, CK20 και EGFR στο περιφερικό αίμα ασθενών με ΚΠΕ και κατόπιν ο προσδιορισμός της κλινικής σημαντικότητάς της. Το στάδιο ανάπτυξης της μεθόδου πραγματοποιήθηκε σε in vitro πειράματα χρησιμοποιώντας την καρκινική κυτταρική σειρά ΗΤ-29, καθώς και μέσω ανάλυσης δειγμάτων ιστού από ασθενείς με ΚΠΕ. Το δεύτερο στάδιο της μελέτης περιλάμβανε την εξέταση, με τη μέθοδο multiplex RTRCR που αναπτύχθηκε, δειγμάτων περιφερικού αίματος από ασθενείς με ΚΠΕ και υγιείς εθελοντές. Συνολικά εξετάστηκαν 88 ασθενείς και 40 υγιείς δότες και στη συνέχεια ακολούθησε ανάλυση των αποτελεσμάτων της multiplex RT-RCR αναφορικά με τη θετική ανίχνευση των δεικτών, σε σχέση με τα κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά καθώς και τη συνολική επιβίωση των ασθενών. Η μέση 139 περίοδος παρακολούθησης των ασθενών ήταν 19 μήνες (8-28 μήνες). Τα ποσοστά των θετικών ανιχνεύσεων των δεικτών στα δείγματα των ασθενών ήταν σημαντικά υψηλότερα σε σχέση με αυτά στα δείγματα των υγιών εθελοντών. Συνολικά 95,5% των ασθενών βρέθηκαν θετικοί για τουλάχιστον έναν από τους δείκτες. Από τους υγιείς μόνο 7,5% βρέθηκαν θετικοί για το mRNA του CEA, ενώ όλοι ήταν αρνητικοί για την CK20 και τον EGFR. Η συσχέτιση του αριθμού των θετικών ανιχνεύσεων τόσο με το στάδιο της νόσου όσο και με τα επίπεδα της πρωτεΐνης CEA του ορρού βρέθηκε να είναι στατιστικώς σημαντική. Η ανάλυση της επιβίωσης αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στη συνολική επιβίωση των διαφορετικών ομάδων των ασθενών, όπως αυτές σχηματίστηκαν σε συνάρτηση με τον αριθμό των θετικών ανιχνεύσεων για τα mRNA των CEA, CK20 και EGFR. Τα πιο πάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν πως η μέθοδος που αναπτύχθηκε είναι μία ιδιαιτέρως ευαίσθητη και ειδική μέθοδος που παρέχει χρήσιμες πληροφορίες σχετικά με το στάδιο της νόσου και τη συνολική επιβίωση. Η συνδυασμένη ανίχνευση των mRNA των δεικτών CEA, CK20 και EGFR σε μία και μόνη αντίδραση θα μπορούσε να έχει σημαντική κλινική αξία για την έγκαιρη ανίχνευση υπολειπόμενης νόσου και την παρακολούθηση των ασθενών που πάσχουν από ΚΠΕ