Μελέτη και κλινική αξιολόγηση δεικτών μεθυλίωσης DNA στον καρκίνο του μαστού

Abstract

Epidemiological studies have shown that breast cancer is the second cause of death from malignancy and the first in women between 40-49 years of age. The emerging field of epigenetics revealed that DNA methylation is an important regulator of gene transcription and a large body of evidence has demonstrated that genes with high levels of 5-methylcytosine in their promoter region are transcriptionally silent, and that DNA methylation gradually accumulates upon long-term gene silencing.. Aberrant DNA methylation patterns –compared to normal tissue – have been associated with a large number of human malignancies while methylation may give selective advantage to tumor cells increasing genetic instability and allowing them to metastasize. Abnormal methylation is detectable in early precancerous lesions, suggesting that directly contributes to the malignant transformation of cells and is a late event caused by genetic alterationsIn recent years, the need to identify molecular markers characterized by high sensitivity and specificity in detecting and monitoring early breast cancer has increased. Tumor heterogeneity is one of the major problems limiting the efficacy of targeted therapies and compromising treatment outcomes. Therefore, blood may be a reservoir for collecting DNA from different sources, including CTCs, cfDNA, and occult micrometastatic deposits in secondary organs. As the scope of breast cancer intratumour genetic heterogeneity unravels, analysis of Circulating tumour cells and cell-free plasma DNA contribute for the completion of tumor molecular characterization.Circulating tumor cells (CTCs) are cells that have shed into the vasculature from a primary tumor and circulate in the bloodstream. CTCs thus constitute seeds for subsequent growth of additional tumors (metastasis) in vital distant organs, triggering a mechanism that is responsible for the vast majority of cancerrelated deaths. On the other hand, the presence of extractable amounts of DNA in serum of cancer patients was early identified, suggesting that circulating DNA maybe shed from tumours.In the present phD thesis, we studied DNA methylation of suppressor and metastasis suppressor genes, CST6, SOX17 and BRMS1 developing and applying MSP (Methylation Specific PCR) in primary tumors, cell-free DNA and circulating tumor cells and correlation with clinicopathological features of patients.Firstly, we evaluated the presence of CST6 promoter methylation in cell-free DNA (cfDNA) circulating in plasma of breast cancer patients. CST6 promoter was found highly methylated in cfDNA of breast cancer patients, but not in healthy individuals. CST6 promoter methylation in cfDNA, should be prospectively validated as a novel plasma tumor biomarker for breast cancer in a large cohort of breast cancer patients.We examined for the first time the relationship between epigenetic silencing of BRMS1 and clinical outcome in operable breast cancers and evaluated the expression of BRMS1 protein and BRMS1 methylation status in CTCs using a highly sensitive and specific MSP assay for BRMS1 promoter methylation. Our data show that BRMS1 promoter methylation results in the transcriptional repression of this gene and highlight the potential clinical relevance of this methylation event in operable breast cancer. We show that BRMS1 promoter is methylated in primary tumors of patients with early breast cancer and in corresponding CTC samples but not in noncancerous breast tissues. Additionally, CTCs were highly heterogeneous in respect to BRMS1 expression even in the same patient.Finally we investigated for the first time whether there is a direct connection between the presence of DNA methylation of these three genes in primary tumors and corresponding CTCs and cfDNA in patients with operable breast cancer and verified metastasis. To address this question we have studied DNA methylation of these genes by the same methodology in well characterized matched clinical samples of breast cancer patients. Our results suggest that there is a direct connection between the presence of CTCs and cfDNA in patients with operable breast cancer, after surgical removal of the primary tumor and prove the tumor origin of circulating tumor DNA. The epigenetic characterization of ctDNA has been shown to be a complementary tool with molecular characterization of CTCs for diagnosis, prognosis and management of cancer patients.

Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι ο καρκίνος του μαστού αποτελεί την δεύτερη αιτία θανάτου από κακοήθες νεόπλασμα και την πρώτη αιτία θανάτου γυναικών ηλικίας 40-49 ετών. Η μεθυλίωση του DNA στην περιοχή του υποκινητή αποτελεί σημαντικό ρυθμιστή στην μεταγραφή των γονιδίων και ο ρόλος της στην καρκινογένεση αποτελεί τα τελευταία χρόνια σημαντικό πεδίο έρευνας παγκοσμίως. H παρεκκλίνουσα μεθυλίωση ογκοκατασταλτικών γονιδίων και η ακόλουθη σίγαση τους, μπορεί να δώσει το πλεονέκτημα επιλογής στα νεοπλασματικά κύτταρα, να αυξήσει την γενετική τους αστάθεια και να τους επιτρέψει να μετασταθούν. Η μη φυσιολογική μεθυλίωση είναι ανιχνεύσιμη σε πρώιμες προκαρκινικές αλλοιώσεις, υποδηλώνοντας ότι συμβάλλει άμεσα στον κακοήθη μετασχηματισμό των κυττάρων και δεν είναι όψιμο γεγονός που προκαλείται από γενετικές αλλαγές. Η σύγχρονη έρευνα στο πεδίο διάγνωσης και θεραπευτικής αντιμετώπισης του καρκίνου του μαστού στρέφεται πλέον στην ανεύρεση βιοδεικτών στο αίμα και συγκεκριμένα στα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (CTC) και το ελεύθερο κυττάρων DNA (cfDNA). Ως εκ τούτου, τα τελευταία χρόνια εισήχθηκε από την επιστημονική κοινότητα μια νέα διαγνωστική έννοια: η υγρή βιοψία σύμφωνα με την οποία γίνεται ανάλυση θεραπευτικών στόχων και μεταλλάξεων γονιδίων που είναι υπεύθυνες για την αντίσταση στη θεραπεία. Εξαιτίας της ετερογένειας του καρκινικού ιστού, απομόνωση και ανάλυση του cfDNA και των CTC παρέχει μια ολοκληρωμένη σκιαγράφηση της μοριακής ταυτότητας του όγκου. Τα CTC ανιχνεύονται στο αίμα ασθενών με καρκίνους επιθηλιακής προέλευσης και έχει αποδειχθεί ότι αποτελούν προγνωστικό δείκτη σε σχέση με το ελεύθερο νόσο διάστημα και την ολική επιβίωση, ενώ παράλληλα το cfDNA στον ορό ή πλάσμα των ασθενών αντανακλά το καρκινικό φορτίο με σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης του σε ασθενείς με καρκίνο σε σχέση με τον υγιή πληθυσμό.Σκοπός της διατριβής αυτής είναι η μελέτη της μεθυλίωσης των υποκινητών ογκοκατασταλτικών και κατασταλτικών της μετάστασης γονιδίων, CST6, SOX17 και BRMS1, με την ανάπτυξη τριών μεθόδων MSP(Methylation Specific PCR) σε πρωτοπαθείς όγκους, ελεύθερο κυττάρων DNA και κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα και συσχέτιση με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών. Εξετάσαμε για πρώτη φορά την μεθυλίωση του υποκινητή του ογκοκατασταλτικού γονιδίου CST6 σε cfDNA σε ασθενείς με πρωτοπαθή και μεταστατικό καρκίνο του μαστού καθώς και σε ομάδα ελέγχου υγιών αιμοδοτών Τα αποτελέσματα αποτέλεσαν μια πρώτη ένδειξη της παρουσίας μεθυλίωσης στον υποκινητή της CST6 στο cfDNA από πλάσμα ασθενών με πρώιμο καρκίνο του μαστού. Η μεθυλίωση του γονιδίου αυτού αποτελεί έναν εξαιρετικά ειδικό βιοδείκτη καρκινογένεσης δεδομένου ότι δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα δείγμα από την ομάδα ελέγχου των υγιών αιμοδοτών. Παρά το γεγονός ότι δεν διαπιστώθηκε συσχέτιση μεταξύ της μεθυλίωσης και του OS και DFI , θεωρούμε ότι κρίνεται απαραίτητη η αξιολόγηση του δείκτη αυτού σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων ασθενών με πρώιμο καρκίνο του μαστού και υγιών αιμοδοτών.Ακολούθησε μελέτη και κλινική αξιολόγηση της μεθυλίωσης του υποκινητή του κατασταλτικού της μετάστασης γονιδίου BRMS1 σε πρωτοπαθείς όγκους, χρησιμοποιώντας μονιμοποιημένους και εγκλεισμένους σε παραφίνης καρκινικούς ιστούς και CTCs σε ασθενείς με πρώιμο καρκίνο του μαστού μετά από μακροχρόνια παρακολούθηση. Τα αποτελέσματα μας αποδεικνύουν την κλινική σημασία του δείκτη μεθυλίωσης του γονιδίου σε ασθενείς με χειρουργήσιμο καρκίνο του μαστού. Η διαγνωστική ειδικότητα του δείκτη αποδείχτηκε με εφαρμογή της ανάλυσης σε ομάδα ελέγχου που συμπεριλάμβανε δείγματα από μη καρκινικούς ιστούς, στους οποίους δεν ανιχνεύθηκε η μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου. Επιπλέον, η μελέτη της έκφρασης και παράλληλα της μεθυλίωσης σε CTC πραγματοποίηθηκε για πρώτη φορά στην βιβλιογραφία, και υπέδειξε για άλλη μια φορά την ετερογένεια των CTC ακόμα και στον ίδιο ασθενή.Ακολούθησε η μελέτη της μεθυλίωσης των υποκινητών SOX17, CST6 και BRMS1 σε πρωτοπαθείς όγκους (δείγματα FFPEs) σε CTC και cfDNA από τους ίδιους ασθενείς. Σκοπός του τελευταίου αυτού άξονα της διατριβής ήταν η διερεύνηση της πιθανής σύνδεσης μεταξύ της προέλευσης του cfDNA και των CTC με το πρωτοπαθή όγκο ή των δύο βιοδεικτών μεταξύ τους σε ασθενείς με πρώιμο και μεταστατικό καρκίνο του μαστού. Τα αποτελέσματα μας αποτελούν μια πρώτη απόδειξη ότι υπάρχει άμεση συσχέτιση μεταξύ των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων και του ελεύθερου κυττάρων DNA και στις δυο υποομάδες ασθενών με καρκίνο του μαστού (με πρώιμο καρκίνο και διαγνωσμένη μετάσταση). Ως εκ τούτου επισημαίνεται ότι η ανίχνευση μεθυλίωσης ενός ή περισσότερων γονιδίων τόσο στο ελεύθερο κυττάρων DNA όσο και κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα αποτελεί ένα πολλά υποσχόμενο μη επεμβατικό δείκτη για την διάγνωση και την πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του μαστού.