Μελέτη με κυτταρομετρία ροής των νεότερων προγνωστικών δεικτών στα χρόνια Β-λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα

Abstract

Introduction: Β-Lymphoproliferative Disorders (B-LPDs) are clonal B cell disorders. Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is the most common leukemia in the Western world. CLL’s clinical course and prognosis are extremely variable. Some patients live for decades with no need for treatment, whereas others have a rapidly aggressive clinical course. Although clinical stages remain the basis for assessing prognosis in CLL, newer prognostic factors are necessary to provide prognosis, especially for early stage disease patients. IgVH mutations and cytogenetic abnormalities offer independent prognostic value but the methods used to determine them are available in a limited number of centres because they are expensive, time consuming and technically demanding. Potential newer prognostic markers such as CD38, proteins ZAP-70 and p53 which are relatively easy to determine by Flow Cytometry (FC) are under investigation. FC is relatively simple and rapidly obtained in most diagnostic laboratories for B-LPD diagnosis but regarding disease prognosis, FC needs validation and standardization. PURPOSE: Validation and standardization of FC regarding CD38, ZAP-70 and p53 determination. Study of the probability for FC to surrogate Immunohistochemistry regarding ZAP-70 protein’s determination and del17p determined by FISH by the determination of p53 protein regarding B-LPD patients. Validation of CD38, ZAP-70 and p53 prognostic significance regarding CLL patients. Identification of newer prognostic factors of independent prognostic value, in order to assess the need for therapy regarding CLL patients, especially early stage CLL patients. This will assist in identifying low risk patients who will develop progressive disease and may benefit from early and/or more intensive treatment (risk stratification). Materials and methods: 100 consecutive B-LPD patients from a single institution were enrolled in the study and were followed for 1-216 months (median 35 months), 60 (60%) men, aged 40-88 years (median 68 years). Patients were divided in two groups. Group A: 80 CLL patients, 52 (65%) men, median diagnosis age 67 years, median follow-up time 37 months. 54 (67,5%) patients, which is the majority among CLL patients, were stage 0, according to the Rai staging system (low risk patients). Group B: 20 B-LPD patients, 8 (40%) men, median diagnosis age 74 years, median follow-up time 25,5 months. High-risk genomic aberrations such as del17p were analyzed by Fluorescence in Situ Hybridization (FISH), ZAP-70 protein was determined by Immunohistochemistry and Flow Cytometry (FC), CD38 and p53 expression by triple-colour FC both in peripheral blood and bone marrow aspiration. Two different FC protocols were evaluated regarding intracellular antigens (ZAP-70 and p53 proteins). LDH and β2-microglobulin were also determined. RESULTS: We found high CD38 expression in 56 (56%) patients, high ZAP-70 expression in 62 (62%) and high p53 expression in 28 (29,9%) patients regarding peripheral blood measurements. Using Spearmann coefficient we found positive correlation between peripheral blood and bone marrow aspiration results for all the three markers (p<0,0001). k coefficient of agreement and Mc Nemars and Bowkers test revealed positive correlation between FC and Immunohistochemistry regarding ZAP-70 determination and between FISH and FC regarding the determination of del17p and p53 protein, respectively (p=1). The optimum cut-off point for FC was determined using ROC curves and was found to be 10%, 20% and 12,5% for CD38, ZAP-70 and p53, respectively. Using MANOVA fit for CD38 and Wilcoxon-Sign Rank test for ZAP-70 we found that both markers were not stable during the course of the disease (p=0,017, p=0,003, respectively). The rest of the study concerns CLL patients (Group A). No correlations were determined in Group B because of the small number of patients. Using χ² we found that high CD38, ZAP-70 or p53 expression was positively related to the need for therapy (p=0,025, p=0,013 and p<0,001). But using ROC curves we found that only CD38 and p53 were of independent prognostic significance. In multivariate analysis p53 was identified as independent prognostic factor, indicating that p53 alone can predict the need for therapy in CLL. Independent prognostic significance was also established for clinical staging, LDH and β2-microglobulin (p=0,002, p=0,025 and p<0,001). No correlation was found between the three markers and the Time To First Treatment (TTT) (Log-rank test p=0,545, p=0,102 and p=0,646) or relapsed disease (χ² p=0,930, p=0,360 and p=0,475). Finally using χ² we found that CD38, p53 and their combination predict the need for therapy for the sensitive and numerous group consisted from low risk CLL patients (p=0,02, p=0,02 and p=0,005). CONCLUSIONS: It is in our opinion that FC represents a very good tool in order to determine CD38 and ZAP-70 and p53 proteins both in peripheral blood and bone marrow aspiration. Our improved protocol can be incorporated into the B-LPDs diagnostic protocol. FC surrogates Immunohistochemistry regarding ZAP-70 determination and del17p determined by FISH with the determination of p53 protein. CD38 and ZAP-70 expression determined by FC failed to maintain stable during the course of CLL, so we propose their determination more than once and especially when CD38 and ZAP-70 negative patients develop progressive disease. The optimum cut-off points that we determined for CD38 and ZAP-70 agree with those given by international studies and ERIC (European Research Initiative on CLL). The optimum cut-off point proposed for p53 protein is different than the cut-off point used internationally and has to be evaluated in larger cohorts of patients. CD38, ZAP-70 and p53 proteins determined by FC are of independent prognostic value concerning the need for treatment and add to the classical assessment of CLL provided by staging systems, LDH and β2-microglobulin, right after diagnosis. In multivariate analysis, p53 alone can predict the need for therapy in CLL. CD38, p53 and their combination distinguished early-stage patients who will need therapy from those whose disease will remain indolent and will not benefit from early treatment. Due to the small number of patients we could not establish any correlation between the three prognostic factors and TTT. Finally, due to limited follow up time we could not establish any correlation between CD38, ZAP-70, p53 and relapsing disease or survival.

Εισαγωγή: Τα χρόνια Β Λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα (Β-ΛΥΝ) είναι κλωνικές παθήσεις των Β λεμφοκυττάρων. Η Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία (ΧΛΛ) είναι η πιο συχνή μορφή λευχαιμίας στο Δυτικό κόσμο. Η κλινική της πορεία και η πρόγνωση εμφανίζουν μεγάλη ετερογένεια. Ορισμένοι ασθενείς ζουν για δεκαετίες χωρίς να χρειάζονται θεραπεία, ενώ άλλοι έχουν γρήγορη εξέλιξη και επιθετική νόσο. Αν και τα συστήματα σταδιοποίησης παραμένουν η βάση για την εκτίμηση της πρόγνωσης στη ΧΛΛ, νεότεροι προγνωστικοί δείκτες είναι απαραίτητοι για την πρόγνωση, ειδικά, για τους ασθενείς σε αρχικό στάδιο νόσου. Η κατάσταση των μεταλλάξεων των IgVH και οι κυτταρογενετικές ανωμαλίες έχουν ανεξάρτητη προγνωστική αξία, αλλά οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό τους είναι διαθέσιμες σε μικρό αριθμό κέντρων διότι είναι ακριβές, χρονοβόρες και τεχνικά δύσκολες. Πιθανοί νεότεροι προγνωστικοί δείκτες, όπως το CD38 και οι πρωτεΐνες ΖΑΡ-70 και p53 που είναι σχετικά εύκολο να προσδιοριστούν με Κυτταρομετρία ροής (ΚΡ) είναι υπό μελέτη. Η ΚΡ είναι σχετικά εύκολη και γρήγορη και διαθέσιμη στα περισσότερα κλινικά εργαστήρια για τη διάγνωση των Β-ΛΥΝ, αλλά για την πρόγνωση των νοσημάτων αυτών χρειάζεται αξιολόγηση και προτυποποίηση. Σκοπός: Μελέτη της μεθόδου της ΚΡ και βελτιστοποίησή της, όσον αφορά στον προσδιορισμό CD38, ΖΑΡ-70 και p53. Μελέτη της δυνατότητας υποκατάστασης της ανοσοϊστοχημείας με την ΚΡ, στον προσδιορισμό της πρωτεΐνης ΖΑΡ-70 και της del17p που προσδιορίζεται με FISH με τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης p53 με ΚΡ, σε ασθενείς με Β-ΛΥΝ. Εκτίμηση της προγνωστικής αξίας της έκφρασης των CD38, ZAP-70 και p53 σε ασθενείς με ΧΛΛ. Ανακάλυψη νεότερων προγνωστικών δεικτών με ανεξάρτητη προγνωστική αξία με σκοπό να προσδιοριστεί η ανάγκη έναρξης θεραπείας των ασθενών με ΧΛΛ και ειδικά ασθενών χαμηλού κινδύνου. Αυτό θα βοηθήσει στον εντοπισμό των ασθενών χαμηλού κινδύνου που θα εμφανίσουν πρόοδο νόσου και θα ωφεληθούν από την εφαρμογή πρώιμης και/ή πιο επιθετικής θεραπείας, θα βοηθήσει, δηλαδή, στην εξατομίκευση της θεραπείας με βάση τη διαστρωμάτωση κινδύνου. Υλικό και μέθοδος: 100 συνεχόμενοι ασθενείς από ένα κέντρο αναφοράς συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη και παρακολουθήθηκαν για 1-216 μήνες (διάμεση τιμή 35 μήνες), 60 (60%) άνδρες ηλικίας 40-88 ετών (διάμεση ηλικία 68 έτη). Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε δύο ομάδες. Ομάδα Α: 80 ασθενείς πάσχοντες από ΧΛΛ, 52 (65%) άνδρες με μέση ηλικία διάγνωσης τα 67 έτη και διάμεσο χρόνο παρακολούθησης τους 37 μήνες. 54 (67,5%) από τους ασθενείς της Ομάδας Α, που είναι και η πλειοψηφία των ασθενών με ΧΛΛ ήταν σταδίου 0 κατά Rai (ασθενείς χαμηλού κινδύνου). Ομάδα Β: 20 ασθενείς με Β-ΛΥΝ, 8 (40%) άνδρες, με διάμεση ηλικία διάγνωσης τα 74 έτη και διάμεσο χρόνο παρακολούθησης τους 25,5 μήνες. Υψηλού κινδύνου γενετικές διαταραχές, όπως η έλλειψη στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 17 (del17p) προσδιορίστηκαν με Fluorescence in situ Hybridization (FISH), η πρωτεΐνη ΖΑΡ-70 προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημεία και ΚΡ, η έκφραση του CD38 και της πρωτεΐνης p53 προσδιορίστηκε με ΚΡ και πρωτόκολλο τριών χρωμάτων τόσο στο περιφερικό αίμα, όσο και στο μυελό των οστών. Δύο διαφορετικά πρωτόκολλα εργασίας αξιολογήθηκαν, όσον αφορά στον προσδιορισμό ενδοκυττάριων αντιγόνων, όπως οι πρωτεΐνες ΖΑΡ-70 και p53. Προσδιορίστηκαν επίσης, η γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) και η β2-μικροσφαιρίνη. Αποτελέσματα: Βρέθηκαν 56 (56%) ασθενείς με θετικό CD38, 62 (62%) με θετική ΖΑΡ-70 και 28 (29,9%) με θετική p53 στο περιφερικό αίμα. Με το συντελεστή συσχέτισης Spearmann βρέθηκε θετική συσχέτιση ανάμεσα στο περιφερικό αίμα και στο μυελό των οστών και για τους τρεις δείκτες (p<0,0001). Με το συντελεστή συμφωνίας k και με έλεγχο με Mc Nemars και Bowkers test βρέθηκε θετική συσχέτιση ανάμεσα στην ανοσοϊστοχημεία και στην ΚΡ όσον αφορά στον προσδιορισμό της πρωτεΐνης ΖΑΡ-70 και ανάμεσα στην del17p που προσδιορίζεται με FISH και την πρωτεΐνη p53 που προσδιορίζεται με ΚΡ (p=1). Το βέλτιστο όριο θετικότητας για την ΚΡ προσδιορίστηκε με καμπύλες ROC και βρέθηκε να είναι 10%, 20% και 12,5% για το CD38, την ΖΑΡ-70 και την p53, αντίστοιχα. Χρησιμοποιώντας MANOVA fit για το CD38 και το Wilcoxon-Sing Rank test για την ΖΑΡ-70 βρήκαμε ότι και οι δύο δείκτες δεν είχαν σταθερή έκφραση στην πορεία της νόσου (p=0,017 και p=0,003, αντίστοιχα). Η υπόλοιπη μελέτη αφορά στους ασθενείς με ΧΛΛ (Ομάδα Α). Δεν έγιναν συσχετίσεις στην Ομάδα Β εξαιτίας του μικρού αριθμού των ασθενών της. Με το κριτήριο χ² βρέθηκε ότι θετική έκφραση CD38, ΖΑΡ-70 ή p53 συσχετίζεται με την ανάγκη έναρξης θεραπείας (p=0,025, p=0,013 p<0,001, αντίστοιχα), με τις καμπύλες ROC, όμως, μόνο το CD38 και η p53 βρέθηκαν να έχουν ανεξάρτητη προγνωστική αξία. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση μόνο η p53 βρέθηκε να έχει ανεξάρτητη προγνωστική αξία, δείχνοντας ότι η p53 μόνη της μπορεί να προβλέψει την ανάγκη έναρξης θεραπείας στη ΧΛΛ. Ανεξάρτητη προγνωστική αξία βρέθηκαν να έχουν και οι παλαιότεροι προγνωστικοί δείκτες, το κλινικό στάδιο της νόσου, η LDH και η β2-μικροσφαιρίνη (χ², p=0,002, p=0,025 και p<0,001, αντίστοιχα). Δε βρέθηκε συσχέτιση ανάμεσα στους τρεις δείκτες και στο χρόνο έναρξης της θεραπείας (Time To First Treatment, TTT) (Log-rank test, p=0,545, p=0,102 and p=0,646) και στην υποτροπή της νόσου (χ², p=0,930, p=0,360 and p=0,475). Τέλος, με το κριτήριο χ² βρέθηκε ότι το CD38 και η p53 προβλέπουν την ανάγκη έναρξης θεραπείας στην ευαίσθητη και πολυπληθή ομάδα των ασθενών χαμηλού κινδύνου (p=0,02, p=0,02 and p=0,005). Συμπεράσματα: Η ΚΡ αποτελεί ένα πολύ καλό εργαλείο για τον προσδιορισμό του CD38 και των πρωτεϊνών ΖΑΡ-70 και p53 τόσο στο περιφερικό αίμα, όσο και στο μυελό των οστών. Το βελτιωμένο πρωτόκολλο εργασίας που χρησιμοποιήσαμε στη μελέτη μπορεί να ενσωματωθεί στο διαγνωστικό πρωτόκολλο των Β-ΛΥΝ. Η ΚΡ μπορεί να υποκαταστήσει την ανοσοϊστοχημεία στον προσδιορισμό της πρωτεΐνης ΖΑΡ-70 και τον προσδιορισμό της del17p που προσδιορίζεται με FISH με τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης p53 στους ασθενείς με Β-ΛΥΝ. Η έκφραση του CD38 και της ΖΑΡ-70 δεν ήταν σταθερή στην πορεία της ΧΛΛ, οπότε προτείνουμε τον προσδιορισμό τους περισσότερες από μία φορές και κυρίως στους ασθενείς που ήταν αρνητικοί για τους δείκτες αυτούς και εμφάνισαν πρόοδο νόσου. Τα βέλτιστα όρια θετικότητας που βρήκαμε για το CD38 και τη ΖΑΡ-70 συμφωνούν με αυτά που δίνουν διεθνείς μελέτες και η ERIC (European Research Initiative on CLL). Το βέλτιστο όριο θετικότητας για την πρωτεΐνη p53 διαφέρει από αυτό που χρησιμοποιείται διεθνώς και πρέπει να επιβεβαιωθεί σε μεγαλύτερες σειρές ασθενών. Το CD38 και οι πρωτεΐνες ΖΑΡ-70 και p53 που προσδιορίζονται με ΚΡ έχουν ανεξάρτητη προγνωστική αξία όσον αφορά στον προσδιορισμό της ανάγκης έναρξης θεραπείας και βοηθούν στην αξιολόγηση της πορείας των ασθενών με ΧΛΛ που γίνεται με τους κλασικούς προγνωστικούς δείκτες που είναι το κλινικό στάδιο της νόσου, η LDH και η β2-μικροσφαιρίνη, αμέσως μετά τη διάγνωση. Από την πολυπαραγοντική ανάλυση φαίνεται ότι η πρωτεΐνη p53 μόνη της μπορεί να προβλέψει την ανάγκη έναρξης θεραπείας στη ΧΛΛ. Το CD38, η p53 και ο συνδυασμός τους μπορεί να διακρίνει τους ασθενείς σε αρχικό στάδιο νόσου που θα χρειαστούν θεραπεία από αυτούς που η νόσος τους θα παραμείνει σταθερή και δε θα ωφεληθούν από πρώιμη έναρξη θεραπείας. Εξαιτίας του μικρού αριθμού των ασθενών δεν εδραιώθηκε συσχέτιση ανάμεσα στους τρεις δείκτες και το χρόνο έναρξης θεραπείας. Εξαιτίας του μικρού χρονικού διαστήματος παρακολούθησης των ασθενών δεν εδραιώθηκε συσχέτιση ανάμεσα στο CD38, τη ΖΑΡ-70 και την p53 και την υποτροπή της νόσου ή την επιβίωση των ασθενών.