Επικύρωση μεθόδου και μελέτη ανοσοφαινότυπου NK και Τ λεμφοκυττάρων με κυτταρομετρία ροής

Abstract

Background: Natural killer (NK) and NKT cells are important elements in innate immunedefense. Their unequivocal identification requires at least three markers (CD3, CD16, CD56).Based on the expression of additional markers, they can be further divided into functionalsubsets. Aim: The purpose of this study was the clarification of the importance of the phenotypic markers of human NK and NKT cells definition in subjects with a significant increase of these cells percentage. Material-Method: (Α) Study of the immunophenotype by four colour flow cytometry of NKand NKT cells from 20 healthy individuals, 20 HIV(+) patients with increased NK percentage, 15 patients with reactive NK lymphocytosis, 12 patients with NK lymhocytosis,17 patients with CD8 lymphocytosis and 24 couples with unexplained recurrent spontaneous abortions (URSA). Peripheral blood lymphocytes were labeled with monoclonal antibodies by direct whole blood staining. The combination of twenty four monoclonal antibodies: CD3,CD56, CD16, CD2, CD7, CD45RA, CD45RO, CD11a, CD57, CD11c, HLADR, TCRγδ,CD8, CD4, CD11b, CD158a, CD158b, NKp44, NKp30, NKp46, KIRp70, KARp50.3,perforin and granzyme A was used for the immunophenotypic study of NK and NKT cells and their subsets. (B) Flow cytometer performance evaluation and validation of NK and NKT protocol, as well as lymphocytes immunophenotype method, using control sample(ImmunoTrolTM), peripheral blood from healthy individuals, women with URSA and patient with NK lymphocytosis. (C) Specimens with malignant populations (B-Chronic Lymphocytic Leukemia, Acute Myeloblastic Leukemia and Myelodysplastic Syndrome) were studied in order to evaluate the suitability of a blood stabilizing reagent (Transfix®) in routine laboratory practice. (D) Determination of the cytotoxic activity of T and NK cells by three colour flow cytometry using K562 cell line and peripheral blood samples from healthy individuals and leukaemic patients (DC2 AL, AML, B-ALL, T-ALL).Results: The flow cytometer performance was found satisfactory at all levels. Within day precision showed that a specimen can be measured safely within a day, without the need of immediate measurement after its treatment. Checking the precision in four consecutive days, indicated that determination of lymphocytes subsets was verified until day three, after the treatment day. Method accuracy was evaluated both through external quality assessment system as well as by comparing measurements of the same specimen in two different flow cytometers and found acceptable. Dilution 1:16 of control specimen was found appropriate to define method detection limit of leukocytes subsets. Method Robustness concluded the following most appropriate conditions: (1) the use of Immunoprep TM red blood lysis reagent system, according to the manufacturer recommendation (Beckman Coulter), (2) the use of75% monoclonal antibody volume suggested by the manufacturer and (3) 5 min incubation time of whole blood with MoAbs. Checking method robustness offered faster and cheaper specimen preparation than the one suggested by the manufacturer. The present study indicates that TransFix® stabilizing reagent can be used reliably in flowcytometric analysis; light scatter characteristics and immunophenotype are well preserved in TransFix®-treated specimens stored at 4-10 o C particularly concerning the blasts and lymphocytes populations for 15 days. It doesn’t seem to preserve granulocytic and monocytic populations, with exception when these populations are pathological. In case cells percentages are limited, specimen preparation must be accomplished as soon as possible (in less than24h).Subsets of NK and NKT cells of HIV+ patients are characterized by non-specific abnormalities, concerning expression of adhesion molecules (CD11a, CD11c), activation markers (CD45RA, CD45RO, HLADR) and cytotoxicity, as studied by perforin and granzyme A expression. Reactive NK lymphocytosis apart from the increased NK cells concerning mainly CD16+ NK cells, showed an increased percentage of NKT cells with nonspecific abnormalities, concerning expression of activation markers (CD45RO, HLADR),receptors of NK cells (inhibitory and cytotoxicity) and cytotoxicity, as studied by perforin andgranzyme A expression, implying subsets malfunction. NK lymphocytosis apart from the increased NK cells, concerning mainly CD16+ NK cells, showed decreased percentage ofCD56+ NK cells and therefore decreased proportion (CD3-CD56+/CD3-CD16+) of NK cells, increased percentage of NKT cells and decreased percentage of T cells, with non-specific abnormalities, concerning expression of adhesion molecules (CD11a), activation markers (CD45RA, HLADR), receptors of NK cells (inhibitory and cytotoxicity) and cytotoxicity, as studied by perforin and granzyme A expression. It should be noted that if immunophenotype correlates with reactive NK lymphocytosis non-specific abnormalities are observed, concerning expression of activation markers (CD45RA, HLADR) and inhibitory receptorCD158a. These findings are not observed in NK lymphocytosis.CD8 lymphocytosis apart from the decreased NK cells and their subsets (CD16+ as well asCD56+) showed an increased percentage of NKT cells, characterized mainly by CD16+ NKT cells, with non-specific abnormalities, concerning expression of adhesion molecules (CD11a,CD11c), activation markers (CD45RA, CD45RO, HLADR), receptors of NK cells (inhibitory and cytotoxicity) and cytotoxicity, as studied by perforin and granzyme A expression, implying subsets malfunction. Subsets of NK and NKT cells of women with URSA with NK cells percentage in normal levels in comparison to respected subsets of women with URSA with increased NK cells percentage (>12%) showed abnormalities, concerning expression of activation markers (CD45RA, CD45RO, HLADR) and receptors of NK cells (CD158a,CD158b, KARp50.3, NKp30, NKp46). Comparison of NK and NKT cells receptors expression between members of couples with URSA showed that there differences inexpression of inhibitory receptors (CD158a, CD158b), as well as cytotoxicity receptors(NKp44, NKp46). Finally, it should be noted that if the immunophenotype of woman with URSA shows increased NK cell percentage abnormalities are observed, concerning expression of activation markers (CD45RO, HLADR), adhesion molecules (CD11a, CD11b),cytotoxicity (as studied by perforin and granzyme A expression) and cytotoxicity receptorNKp46.NK cells in comparison to T cells are more cytotoxic against leukaemic AML cells than leukaemic B-ALL cells. In contrast, leukaemic T-ALL cells are resistant to T as well as to NK cells cytotoxicity. Study of NK cells receptors expression showed that maximum NK cells cytotoxicity is expressed when each NK cell receptor is equivalently expressed in the donor of effector cells and in the leukaemic patient. Contrary, if all NK cells receptors are not expressed in equivalent percentages or only some of them are expressed (inhibitory or cytotoxicity receptors), leukaemic cells seem to be more resistant. Conclusions: Immunophenotyping of NK and NKT cells and their subsets in subjects with a significant increase of these cells percentage seems to provide additional information about cells functionality concerning these pathological entities and chronic infection. In addition, this study could discriminate, through immunophenotype and functional assays, normal from pathological NK cells or cells whose increase is related to underlying disease. Assessment of the above mentioned findings in relation to other clinical and laboratory data could help in the patients’ follow-up and therapeutical decisions, as well as in better understanding and definition of these haematological disorders.

Εισαγωγή: Τα φυσικά κυτταροκτόνα (ΝΚ) και τα ΝΚΤ κύτταρα είναι σημαντικά κύτταρα του ανοσιακού συστήματος. Για το σαφή προσδιορισμό τους απαιτείται η χρήση τριών δεικτών CD3, CD16 και CD56. Οι δύο αυτοί πληθυσμοί κυττάρων μπορούν να καταταχθούν σε περαιτέρω λειτουργικούς υποπληθυσμούς με βάση τη μελέτη έκφρασης πρόσθετων κυτταρικών δεικτών. Σκοπός της εργασίας ήταν η διευκρίνιση της σημασίας του ανοσοφαινότυπου των ΝΚ και ΝΚΤ κυττάρων και των υποπληθυσμών τους σε περιστατικά, όπου παρατηρείται σημαντική αύξηση του ποσοστού των κυττάρων αυτών. Υλικό-Μέθοδος: (Α) Μελέτη ανοσοφαινότυπου με τετραχρωματική ανάλυση με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής των NK και ΝΚΤ κυττάρων σε 20 φυσιολογικούς μάρτυρες, σε 20ασθενείς HIV(+) με αυξημένο ποσοστό ΝΚ κυττάρων, σε 15 ασθενείς με αντιδραστική ΝΚ λεμφοκυττάρωση, σε 12 ασθενείς με ΝΚ λεμφοκυττάρωση, σε 17 ασθενείς με CD8λεμφοκυττάρωση και 24 ζευγάρια με ιστορικό αυτόματων αποβολών αγνώστου αιτιολογίας(ΑΑΑΑ). Τα λεμφοκύτταρα του περιφερικού αίματος επωάζονται με μονοκλωνικά αντισώματα άμεσα συνδεδεμένα με φθορίζουσες ουσίες. Ο συνδυασμός εικοσιτεσσάρων αντισωμάτων: CD3, CD56, CD16, CD2, CD7, CD45RA, CD45RO, CD11a, CD57, CD11c,HLADR, TCRγδ, CD8, CD4, CD11b, CD158a, CD158b, NKp44, NKp30, NKp46, KIRp70,KARp50.3, perforin και granzyme A χρησιμοποιήθηκε για την μελέτη των NK και NKT κυττάρων και των υποπληθυσμών τους. (Β) Έλεγχος καλής λειτουργίας του κυτταρομετρητή ροής και επικύρωση του πρωτοκόλλου μελέτης των ΝΚ και ΝΚΤ κυττάρων, καθώς και της μεθόδου προσδιορισμού του ανοσοφαινότυπου των λεμφοκυττάρων, με χρήση δειγμάτων ελέγχου (ImmunoTrolTM), περιφερικού αίματος φυσιολογικών μαρτύρων, γυναικών με ιστορικό ΑΑΑΑ και ασθενούς με ΝΚ λεμφοκυττάρωση. (Γ) Μελέτη της επίδρασης του μονιμοποιητικού/συντηρητικού υλικού Transfix® στη βιωσιμότητα, τα χαρακτηριστικά σκέδασης και τα χαρακτηριστικά του αντιγονικού προφίλ των λευκοκυττάρων δειγμάτων ελέγχου (ImmunoTrolTM), περιφερικού αίματος φυσιολογικών μαρτύρων, ασθενών με BCLL,AML, AML(M5), και MDS και μυελού των οστών ασθενούς με MDS. (Δ) Μελέτη της κυτταροτοξικότητας των Τ και ΝΚ κυττάρων με τριχρωματική ανάλυση με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής, με χρήση της καρκινικής σειράς Κ562 και δειγμάτων περιφερικού αίματος φυσιολογικών μαρτύρων και ασθενών με λευχαιμία (DC2-ΟΛ, ΟΜΛ, Β-ΟΛΛ, Τ-ΟΛΛ).Αποτελέσματα: Η λειτουργία του κυτταρομετρητή κρίθηκε ικανοποιητική σε όλα τα επίπεδα. Η διερεύνηση της επαναληψιμότητας εντός ημέρας έδειξε ότι ένα δείγμα μπορεί να μετρηθεί εντός της ημέρας, χωρίς να χρειάζεται να μετρηθεί αμέσως μετά την κατεργασία του. Κατά τον έλεγχο της αναπαραγωγιμότητας για διάστημα τεσσάρων συνεχόμενων ημερών, διαπιστώθηκε πιστότητα στα ποσοστά του ανοσοφαινότυπου των λεμφοκυττάρων μέχρι και την τρίτη ημέρα, από την ημέρα επεξεργασίας των δειγμάτων. Ο έλεγχος ακρίβειας της μεθόδου του ανοσοφαινότυπου των λεμφοκυττάρων, που πραγματοποιήθηκε μέσω του διεργαστηριακού ελέγχου επίδοσης του UK-NEQAS και μέσω της σύγκρισης των μετρήσεων ιδίου δείγματος από δυο διαφορετικούς κυτταρομετρητές ροής, κρίθηκε ικανοποιητική. Για τον προσδιορισμό του ορίου ανίχνευσης της μεθόδου προσδιορισμού των υποπληθυσμών των λευκοκυττάρων, αποδείχτηκε ως βέλτιστη η αραίωση 1:16 του δείγματος ελέγχου. Ο έλεγχος ανθεκτικότητας της μεθόδου σε σύγκριση με τις άλλες μεθόδους λύσης ερυθρών αιμοσφαιρίων, επισήμανε τη χρήση του συστήματος αντιδραστηρίων λύσης ερυθρών αιμοσφαιρίων ImmunoprepTM, που προτείνει η εταιρεία Beckman Coulter. Για τη διασφάλιση της σωστής προετοιμασίας των δειγμάτων ο ελάχιστος απαιτούμενος χρόνος επώασης βρέθηκε μειωμένος στα 5 min και η ελάχιστη απαιτούμενη ποσότητα μονοκλωνικού αντισώματος μειώθηκε στο 75% της προτεινόμενης, από την παρασκευάστρια εταιρεία. Με τις μεταβολές αυτές η μέθοδος γίνεται ταχύτερη και οικονομικότερη. Η προσθήκη TransFix® στα δείγματα, που προσέρχονται για εξέταση στο εργαστήριο κυτταρομετρίας ροής, τα οποία αποθηκεύονται στους 4-10 o C, διατήρησε τη βιωσιμότητα, τα χαρακτηριστικά σκεδασμού και τα χαρακτηριστικά του αντιγονικού προφίλ των υποπληθυσμών των λεμφοκυττάρων και των αώρων κυττάρων για 15 ημέρες, ενώ δε φαίνεται να βοηθά ιδιαίτερα στη διατήρηση των ουδετερόφιλων κοκκιοκυττάρων και των μονοκυττάρων, παρά μόνο αν αποτελούν τον παθολογικό πληθυσμό. Στις περιπτώσεις όπου τα ποσοστά των πληθυσμών είναι πολύ χαμηλά συστήνεται η επεξεργασία και μέτρηση του δείγματος το συντομότερο δυνατό (σε διάστημα μικρότερο από 24 ώρες). Οι υποπληθυσμοί των ΝΚ και ΝΚΤ κυττάρων των ασθενών με HIV λοίμωξη χαρακτηρίζονται από ποικίλες διαταραχές, που αφορούν την έκφραση μορίων προσκόλλησης(CD11a, CD11c), δεικτών ενεργοποίησης (HLADR, CD45RA, CD45RO) και κυτταροτοξικότητας, όπως αυτή προσδιορίζεται από την έκφραση περφορίνης και granzyme A. Οι αντιδραστικές ΝΚ λεμφοκυτταρώσεις συνοδεύονται από αύξηση του ποσοστού των ΝΚ, που αφορά κυρίως CD16+ ΝΚ κύτταρα και αύξηση των ΝΚΤ κυττάρων, με ποικίλες διαταραχές του ανοσοφαινότυπου, που αφορούν κυρίως την έκφραση δεικτών ενεργοποίησης(HLADR, CD45RO), υποδοχέων των ΝΚ κυττάρων (ανασταλτικών και κυτταροτοξικών) και κυτταροτοξικότητας, όπως αυτή προσδιορίζεται από την έκφραση περφορίνης και granzyme A, υποδεικνύοντας τη δυσλειτουργία αυτών των πληθυσμών. Αντίστοιχα, οι ΝΚ λεμφοκυτταρώσεις συνοδεύονται από αύξηση του ποσοστού των NK κυττάρων, που αφορά τα CD16+ NK κύτταρα, μείωση των CD56+ NK κυττάρων και επομένως μείωση της αναλογίας (CD3-CD56+/CD3-CD16+) των NK κυττάρων, αύξηση των ΝΚΤ κυττάρων και μείωση των Τ κυττάρων, με ποικίλες διαταραχές του ανοσοφαινότυπου, που αφορούν την έκφραση μορίων προσκόλλησης (CD11α), την έκφραση δεικτών ενεργοποίησης (CD45RA,HLADR), υποδοχέων των ΝΚ κυττάρων (ανασταλτικών και κυτταροτοξικών) και κυτταροτοξικότητας, όπως αυτή προσδιορίζεται από την έκφραση περφορίνης και granzyme A. Αξίζει να σημειωθεί ότι στην περίπτωση που ο ανοσοφαινότυπος σχετίζεται με υποκείμενη νεοπλασία (αντιδραστική ΝΚ λεμφοκυττάρωση) παρατηρούνται διαταραχές των ΝΚ και των ΝΚΤ κυττάρων, που αφορούν την έκφραση δεικτών ενεργοποίησης (CD45RA,HLADR) και του ανασταλτικού υποδοχέα CD158α. Τα ευρήματα αυτά δεν παρατηρούνται στην ΝΚ λεμφοκυττάρωση.Οι CD8 λεμφοκυτταρώσεις συνοδεύονται από μείωση του συνόλου των ΝΚ και των υποπληθυσμών τους (τόσο των CD16+ όσο και των CD56+) και αύξηση των ΝΚΤ κυττάρων, που αφορά κυρίως CD16+ ΝΚΤ κύτταρα, με ποικίλες διαταραχές του ανοσοφαινότυπου, που αφορούν την έκφραση μορίων προσκόλλησης (CD11a, CD11c), δεικτών ενεργοποίησης(HLADR, CD45RA, CD45RO), υποδοχέων των ΝΚ κυττάρων (ανασταλτικών και κυτταροτοξικών) και κυτταροτοξικότητας, όπως αυτή προσδιορίζεται από την έκφραση περφορίνης, υποδεικνύοντας τη δυσλειτουργία αυτών των πληθυσμών. Οι υποπληθυσμοί των ΝΚ και ΝΚΤ κυττάρων των γυναικών με ιστορικό ΑΑΑΑ με ποσοστό ΝΚ κυττάρων σε φυσιολογικά επίπεδα χαρακτηρίζονται από διαταραχές σε σχέση με τους αντίστοιχους υποπληθυσμούς των γυναικών με ιστορικό ΑΑΑΑ με αυξημένο ποσοστό ΝΚ κυττάρων(>12%), οι οποίες αφορούν κυρίως την έκφραση δεικτών ενεργοποίησης (HLADR, CD45RA,CD45RO) και υποδοχέων (CD158a, CD158b, KARp50.3, NKp30, NKp46). Ακολούθως, η σύγκριση της έκφρασης των υποδοχέων των ΝΚ και ΝΚΤ κυττάρων μεταξύ των μελών των ζευγαριών με ιστορικό ΑΑΑΑ υπέδειξε ότι υπάρχει διαφορά έκφρασης των ανασταλτικών υποδοχέων (CD158a, CD158b) και των κυτταροτοξικών υποδοχέων (NKp44, NKp46).Τέλος, πρέπει να σημειωθεί ότι στην περίπτωση που ο ανοσοφαινότυπος γυναίκας με ιστορικό ΑΑΑΑ σχετίζεται με αυξημένο ποσοστό ΝΚ κυττάρων παρατηρούνται διαταραχές των ΝΚ και των ΝΚΤ κυττάρων, που αφορούν την έκφραση δεικτών ενεργοποίησης(CD45RΟ, HLADR), μορίων προσκόλλησης (CD11a, CD11b), κυτταροτοξικότητας (όπως αυτή προσδιορίζεται από την έκφραση της περφορίνης) και του κυτταροτοξικού υποδοχέαΝΚp46.Τα ΝΚ κύτταρα είναι περισσότερο κυτταροτοξικά έναντι των κυττάρων οξείας μυελοβλαστικής λευχαιμίας (ΟΜΛ) παρά έναντι των κυττάρων της Β-οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας (Β-ΟΛΛ) σε σχέση με τα Τ λεμφοκύτταρα. Αντιθέτως, τα κύτταρα της Τ-ΟΛΛ είναι ανθεκτικά στην κυτταροτοξική δράση τόσο των Τ όσο και των ΝΚ κυττάρων. Επίσης, πραγματοποιήθηκε μελέτη έκφρασης των υποδοχέων των ΝΚ κυττάρων. Η μέγιστη κυτταροτοξικότητα των ΝΚ κυττάρων έναντι λευχαιμικών κυττάρων φαίνεται να πραγματοποιείται όταν κάθε κυτταρικός υποδοχέας των ΝΚ κυττάρων εκφράζεται στο ίδιοπερίπου ποσοστό στο δότη των δραστικών κυττάρων και τον ασθενή με λευχαιμία. Σε αντίθετη περίπτωση, όπου είτε δεν εκφράζονται όλοι οι υποδοχείς στο ίδιο ποσοστό είτε εκφράζονται ορισμένοι από αυτούς (ανασταλτικοί ή κυτταροτοξικοί υποδοχείς) τότε τα κύτταρα της λευχαιμίας φαίνεται να είναι πιο ανθεκτικά. Συμπεράσματα: Η μελέτη του ανοσοφαινότυπου των ΝΚ και ΝΚΤ κυττάρων, καθώς και των υποπληθυσμών αυτών, στα παραπάνω περιστατικά, όπου παρατηρείται σημαντική αύξηση του ποσοστού των κυττάρων αυτών επί των λεμφοκυττάρων, φαίνεται να προσθέτει νέες πληροφορίες σχετικά με τις παθολογικές διαταραχές και τη λειτουργία των ΝΚ κυττάρων. Επίσης, η μελέτη αυτή πιθανόν να επιτρέψει τη διάκριση, μέσω του ανοσοφαινότυπου και των λειτουργικών δοκιμασιών, των φυσιολογικών ΝΚ κυττάρων από παθολογικά ΝΚ κύτταρα ή κύτταρα των οποίων η αύξηση αποτελεί αντίδραση σε υποκείμενο νόσημα. Η αξιολόγηση των παραπάνω ευρημάτων σε σχέση με τα κλινικά και εργαστηριακά χαρακτηριστικά θα μπορούσε να βοηθήσει στη θεραπεία και την παρακολούθηση των ασθενών, καθώς και στην καλύτερη κατανόηση και ταξινόμηση των αντίστοιχων αιματολογικών διαταραχών.