Μοριακή πληθυσμιακή ανάλυση στρεπτομυκήτων εδάφους μεσογειακού τύπου: μελέτη φυσικών πλασμιδίων

Abstract

The purpose of this thesis was to explore: • If and at what degree the diversity and the grouping of streptomyces in specific taxa are reflected at the genetic level, • If there is a flow of genetic information between different species of indigenous populations, • And if this is related to the particularities of each environment. RESULTS: The first part of the thesis explores the molecular typing of indigenous streptomyces strains. More specifically, the diversity of 138 indigenous streptomycete isolates was studied; these isolates were previously grouped in the same taxa, based on physiological and biochemical criteria. They were part of the strain collection of the Microbiology lab and had been isolated from soil samples from two areas within Attica: a) Marathonas area (cultivated area), b) Kaisariani area (forest protected area). Also, in the soil samples which were studied, the diversity of the Actinobacteria population was recorded at a molecular level. Population analysis and molecular typing were carried out using the method of Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). Three sets of primers, amplifying part of 16S rDNA gene, were used. The second part of the thesis is related to the question of existence of a genetic information flow between the different species of two streptomycete populations. 138 indigenous Streptomyces strains, which were isolated and identified in our laboratory, were screened for the presence of naturally occurring plasmids. In total, six were found to contain plasmids. These strains were: S. rochei AGAI (pMARl), S. griseomber AGA43 (pMAR2), S. anulatus AGA27 (pMAR3), S. exfoliatus AGA37 (pMAR 4), S. diastaticus AGA50 (pMAR5) and S. anulatus CAG17 (pMAR6). The size of the new plasmids was approximately estimated by restriction analysis with single and double digestions. According to these results, the size of plasmids pMARl, pMAR.3 pMAR5 and pMAR6 ranges between 70 and 80 kb. The equivalent size for plasmids pMAR2 mid pMAR4 ranges between 40 and 50 kb. Cross hybridisations among the new plasmids revealed very high similarities between plasmids pMARl, pMAR3, pMAR5 and pMAR6, but no similarity was detected between the remaining two plasmids (pMAR2 and pMAR4), and the previous ones. Also, no similarity was observed between plasmids pMAR2 and pMAR4. Well characterized plasmids such as pIJ673 and SCP2*, were used as probes in order to investigate the existence of similarities between the new plasmids and the known ones. No homologies were detected. New plasmids were also used as probes at colony hybridisation experiments with all 138 isolates, in order to investigate the presence of integrated sequences. No signal was detected. To obtain better knowledge about putative phenotypes associated with these plasmids but also in order to interpret their presence in the indigenous populations, they were used as probes in hybridization experiments against Streptomyces coelicolor A3(2) cosmid library. None of the plasmids showed significant similarity with the chromosomal DNA. Within the experiments’ framework regarding plasmid characterisation, the stability, mobility and the linearity of the plasmids were investigated. The new natural plasmids presented high stability even after the effect of thermal shock, antimicrobial and chemical factors. Experiments of pulse field gel electrophoresis revealed that the four host strains of natural plasmids pMARl, pMAR3, pMAR5 and pMAR6, were also hosts of linear plasmids. The linear and cyclical form of the plasmids presented a high homology. In addition all plasmids were tested for pock formation. Pocks were observed in all cases suggesting that the new plasmids were transferred from the host strains to plasmid-free strain S. lividans TK23, whilst furthermore, the strain S. rochei AGA1 presented an ability of mobilization of non-conjugative plasmid pIJ702. Studies on the distribution studies of the new natural plasmids, would allow us to estimate their real host range and to investigate prevalence of horizontal plasmid transfer. Therefore, 257 streptomyces isolates of the laboratory collection were screened for the presence of the new plasmids. These strains were isolated from 7 different Greek soil ecosystems. 6 strains presented a positive result in all repetitions, (S. rochei AMI6, S. rochei AM35, S. rochei AK21, S. viridosporus AM29, S. viridosporus AM37 and S. venezuelae AM32). As far as their geographical distribution is concerned, five strains belonged to the population ofthe Marathon area, as strain AGAl, whilst strain S. rochei AK 21 was originated from the area of Kaisariani. Finally, the phylogenetic relations of indigenous host strains were studied through alignment of 16S rDNA sequences, as well as the physiological characteristics of the strains. Furthermore, their life cycle was examined, and completed with strain S. lividans TK24+pIJ673 which was used as control in soil microcosms experiments.

Σκοπός της διατριβής αυτής ήταν να ερευνηθεί : • αν και σε ποιο βαθμό η ποικιλομορφία και η ομαδοποίηση των στρεπτομυκήτων σε συγκεκριμένες ταξινομικές ομάδες αντικατοπτρίζεται στο γενετικό επίπεδο, • αν υπάρχει ροή γενετικής πληροφορία ανάμεσα σε διαφορετικά είδη ενδογενών πληθυσμών; • και αν αυτή συσχετίζεται με τις ιδιαιτερότητες κάθε περιβάλλοντος ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Το πρώτο μέρος της διατριβής αφορά στη μοριακή τυποποίηση ενδογενών στελεχών στρεπτομυκήτων. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η ποικιλομορφία 138 ενδογενών στελεχών στρεπτομυκήτων που βάση φυσιολογικών και βιοχημικών κριτηρίων είχαν ενταχθεί στην ίδια ταξινομική ομάδα. Τα στελέχη αυτά προέρχονταν από τη συλλογή του εργαστηρίου Μικροβιολογίας του Τομέα Βοτανικής, και είχαν απομονωθεί από δείγματα εδάφους δύο περιοχών της Αττικής: α) Περιοχή Μαραθώνα (καλλιεργούμενη περιοχή), β) Περιογή Καισαριανής (δασώδης προστατευόμενη περιοχή). Επίσης, στα δείγματα εδάφους που μελετήθηκαν, καταγράφηκε η ποικιλότητα, σε μοριακό επίπεδο, του ευρύτερου πληθυσμού των Ακτινοβακτηρίων. Η πληθυσμιακή ανάλυση και η μοριακή τυποποίηση πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης με αποδιατακτικό παράγοντα υπό κλίση (DGGE). Χρησιμοποιήθηκαν 3 διαφορετικά ζεύγη μορίων εκκινητών που ενισχύουν τμήματα της 16S rDNA αλληλουχίας. Το δεύτερο μέρος της διατριβής σχετίζεται με το ερώτημα ύπαρξης ροής γενετικής πληροφορία ανάμεσα στα διαφορετικά είδη των δύο πληθυσμών στρεπτομυκήτων. 138 ενδογενή στελέχη στρεπτομυκήτων που απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν στο εργαστήριό μας ελέγχθηκαν για την παρουσία αυτόνομων κυκλικών υπερελικωμένων πλασμιδίων. Συνολικά βρέθηκαν έξι απομονοθέντα στελέχη φορείς πλασμιδίων. Πρόκειται για τα S. rochei AGAI (pMARl), S. griseoruber AGA43 (pMAR2), S. anulatus AGA27 (pMAR3), S. exfoliatus AGA37 (pMAR 4), 5. diastaticus AGA50 (pMAR5) και S. anulatus CAG17 (pMAR6). Από τα πρότυπα των πέψεων προέκυψε ότι το μέγεθος των πλασμιδίων pMARl, pMAR3 pMAR5 και pMAR6 κυμαίνεται μεταξύ 70 και 80 kb. Το αντίστοιχο μέγεθος για τα πλασμίδια pMAR2 και pMAR4 είναι από 40 έως 50 kb. Πειράματα υβριδισμού αποκάλυψαν ότι τα τέσσερα πλασμίδια, pMARl, pMAR3, pMAR5 και pMAR6, εμφάνισαν πολύ υψηλό ποσοστό ομολογίας. Αντίθετα τα πλασμίδια pMAR2 και pMAR4, δεν έδειξαν καμία ομολογία με τα προηγούμενα πλασμίδια αλλά επίσης δεν εμφάνισαν και καμία ομολογία μεταξύ τους. Επίσης δεν ανιχνεύθηκαν ομολογίες των φυσικών πλασμιδίων με γνωστά πλασμίδια στρεπτομυκήτων όπως το piJ101 και toSCP2* ενώ από πειράματα υβριδισμού αποικιών έδειξαν απουσία ομολογίας των φυσικών πλασμιδίων με το ολικό DNA των 138 στελεχών. Στην προσπάθεια εύρεσης φαινοτυπικών χαρακτηριστικών-μαρτύρων των πλασμιδίων αλλά και ερμηνείας της παρουσίας τους στους ενδογενείς πληθυσμούς πραγματοποιήθηκαν πειράματα υβριδισμού με τη βιβλιοθήκη των 200 κοσμιδίων στην οποία κλωνοποιήθηκε το γενετικό υλικό του στελέχους S. coelicor Α3(2) (8 Mb), δεν παρατηρήθηκαν όμως σημαντικές ομολογίες. Στα πλαίσια πειραμάτων για τον χαρακτηρισμό των πλασμιδίων μελετήθηκε η σταθερότητα, η κινητικότητα και η γραμμικότητά τους. Τα νέα φυσικά πλασμίδια εμφάνισαν ιδιαίτερη σταθερότητα ακόμα και μετά από επίδραση θερμικού σοκ, αντιμικροβιακών και χημικών παραγόντων. Πειράματα ηλεκτροφόρησης εναλλασσόμενου πεδίου αποκάλυψαν ότι τα τέσσερα στελέχη ξενιστές των φυσικών πλασμιδίων pMARl, pMAR3, pMAR5 και pMARó , ήταν επίσης ξενιστές γραμμικών πλασμιδίων. Η γραμμική και κυκλική μορφή των πλασμιδίων εμφάνισε πολύ υψηλή ομολογία. Τα νέα φυσικά πλασμίδια εμφάνισαν επίσης συζευκτική ικανότητα σε πειράματα σύζευξης με το στέλεχος S. lividans ΤΚ23, ενώ επιπλέον το στέλεχος 5. rochei AGAI εμφάνισε ικανότητα κινητοποίησης του μη συζευκτικού πλασμιδίου pIJ702. Η μελέτη της διασποράς των νέων φυσικών πλασμιδίων σε πληθυσμούς στρεπτομυκήτων, απομονωμένους από διαφορετικά και απομακρυσμένα περιβάλλοντα, θα παρείχε επιπλέον πληροφορίες για την εκτίμηση του πραγματικού εύρους των ξενιστών και του ρόλου τους στη ροή γενετικής πληροφορίας ανάμεσα στις διαφορετικές ταξινομικές ομάδες αυτών των πληθυσμών. Στα πλαίσια αυτής της μελέτης εξετάστηκαν συνολικά 257 στελέχη της συλλογής στρεπτομυκήτων του εργαστηρίου μας, προερχόμενα από 7 διαφορετικά ενδιαιτήματα του ελλαδικού χώρου. Από τη συλλογή στρεπτομυκήτων που εξετάστηκε, 6 στελέχη παρουσίαζαν σε όλες τις επαναλήψεις θετικό αποτέλεσμα. Πρόκειται για τα στελέχη S. rochei AM 16, S. rochei AM35, S. rochei AK21, S. viridosporus AM29, S. viridosporus AM37 και S. venezuelae AM32. Τρία από τα στελέχη αυτά ανήκαν στην ταξινομική υποομάδα S. rochei στην οποία ανήκει και το στέλεχος AGA1 ξενιστής του πλασμιδίου pMARl. Δύο ανήκαν στην ταξινομική υποομάδα S. viridosporus και ένα στην υποομάδα S. venezuelae. Όσον αφορά τη γεωγραφική τους κατανομή, πέντε στελέχη ανήκαν στον πληθυσμό της περιοχής Μαραθώνα (όπου ανήκε και στέλεχος AGA1), ενώ το στέλεχος S. rochei AK 21 προερχόταν από την περιοχή της Καισαρισανής. Τέλος μελετήθηκαν οι φυλογενετικές σχέσεις των ενδογενών στελεχών - ξενιστών στρεπτομυκήτων μέσω σύγκρισης αλληλουχιών 16S rDNA, καθώς και τα φυσιολογικά χαρακτηριστικά των στελεχών, όπως η ανθεκτικότητά τους σε αντιβιοτικά, που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν παράλληλα και ως μάρτυρες σε πειράματα συζεύξεων. Επιπλέον εξετάστηκε ο κύκλος ζωής των έξι στελεχών, S. rochei AGA1 (pMARl), S. griseoruber AGA43 (pMAR2), S. anulatus AGA27 (pMAR3), S. exfoliatus AGA37 (pMAR 4), S. diasiaticus AGA50 (pMAR5) και S. anulatus CAG17 (pMAR6), καθώς και του στελέχους S. lividans TK24+pIJ673 t, σε συστήματα μικροκόσμων εδάφους.